Amplicon Seq

Amplicon sequencing to technika sekwencjonowania polegająca na analizie specyficznych fragmentów DNA (ampliconów), które są amplifikowane przy użyciu reakcji PCR. Najczęściej stosuje się ją do identyfikacji mikroorganizmów w badanym materiale poprzez analizę wybranych regionów genomu takich jak 16S rRNA (dla bakterii), ITS (dla grzybów), 18S (eukarioty).

Przebieg procesu Amplicon Seq

Zastosowanie Amplicon Seq

Amplicon sequencing jest popularny dzięki precyzji, stosunkowo niskim kosztom i możliwości jednoczesnego analizowania wielu próbek.

Charakterystyka techniczna Amplicon Seq

Specyfikacja: Illumina

• Tryb sekwencjonowania: 2x250bp
• Standardowa do wyboru ilość danych na próbkę:
  • 30k par odczytów (tags)
  • 50k par odczytów (tags) - standardowe, rekomendowane podejście
  • 100k par odczytów (tags)
  • Inna / Niestandardowa (na specjalne życzenie klienta).
• Dostępne opcje wyboru regionu do amplifikacji:
  • 16S - identyfikacja bakterii:
    • V3+V4 - standardowe podejście. Proponowane startery: 338F i 806R
    • V4+V5 - proponowane startery: 515F i 926R
    • V4 - proponowane startery: 515F i 806R2
    • Archea V3+V4 - proponowane startery: Arch349F i Arch806R
  • ITS - identyfikacja grzybów:
    • ITS1 - standardowe podejście. Proponowane startery: ITS1F i ITS2
    • ITS2 - Proponowane startery: ITS2F i ITS2R.
  • 18S - identyfikacja eukariotycznego rRNA:
    • V4 - Proponowane startery: TAReuk454FWD1 i TAReukREV3
    • V7 - Proponowane startery: 960F i NSR1438

• Rekomendowane wymagania dotyczące próbek (Illumina):
  • Typ próbki: gDNA
  • Ilość: > 500ng
  • Koncentracja (NanoDrop): >20 ng/μL
  • Objętość: >20 μL
  • Czystość (OD260/280): 1.6 - 2.5
• MINIMALNE wymagania dotyczące próbek (Illumina):
  • Typ próbki: gDNA
  • Ilość: > 300ng
  • Koncentracja (Qubit): >1 ng/μL
  • Objętość: >20 μL

Możliwa jest również izolacja DNA z dostarczonych próbek. Szczegóły tutaj.

Specyfikacja: PacBio

• Długie odczyty, HiFi
• Standardowa do wyboru ilość danych na próbkę:
  • 10k par odczytów (tags)
  • 30k par odczytów (tags)
  • 50k par odczytów (tags)
  • Inna / niestandardowa (na specjalne życzenie klienta).
• Dostępne opcje wyboru regionu do amplifikacji:
  • 16S (cały fragment ok. 1.5 Kb długości, od V1 do V9). Proponowane startery: 27F i 1492R
  • ITS (cały fragment ok. 0.5-0.7 Kb długości, od ITS1 do ITS2). Proponowane startery: ITS1 i ITS4
  • 18S (cały fragment ok. 1.8 Kb długośc). Proponowane startery: Euk-A i Euk-B
• Rekomendowane wymagania dotyczące próbek (PacBio):
  • Typ próbki: gDNA
  • Ilość: > 1500ng
  • Koncentracja (NanoDrop): >50 ng/μL
  • Objętość: >20 μL
  • Czystość (OD260/280): 1.6 - 2.5
• MINIMALNE wymagania dotyczące próbek (PacBio):
  • Typ próbki: gDNA
  • Ilość: > 1000ng
  • Koncentracja (Qubit): >20 ng/μL
  • Objętość: >20 μL

Możliwa jest również izolacja DNA z dostarczonych próbek. Szczegóły tutaj.

Analiza bioinformatyczna Amplicon Seq

Zaawansowana analiza bioinformatyczna w pakiecie Amplicon Seq obejmuje m.in.:

• Analiza OTU/ASV
• Adnotacja taksonomiczna i względna obfitość
• Analiza różnorodności alfa
• Analiza różnorodności beta
• Analiza różnicowa między grupami
• Analiza korelacji
• Predykcja genów funkcjonalnych 16S / ITS / 18S