Amplicon Seq

Amplicon sequencing to technika sekwencjonowania polegająca na analizie specyficznych fragmentów DNA (ampliconów), które są amplifikowane przy użyciu reakcji PCR. Najczęściej stosuje się ją do identyfikacji mikroorganizmów w badanym materiale poprzez analizę wybranych regionów genomu takich jak 16S rRNA (dla bakterii), ITS (dla grzybów), 18S (eukarioty).

Przebieg Procesu Amplicon Seq

1. Wybór starterów: Dobór specyficznych primerów do amplifikacji docelowego regionu DNA.
2. Amplifikacja PCR: Namnażanie wybranych fragmentów DNA.
3. Oczyszczenie produktu PCR: Usuwanie pozostałości enzymów, primerów i niespecyficznych produktów.
4. Przygotowanie bibliotek: Dodanie adapterów do sekwencjonowania i indeksów (umożliwiających multiplexing).
5. Sekwencjonowanie: Analiza na platformach Illumina lub Pac-Bio.
6. Analiza bioinformatyczna: Identyfikacja taksonomiczna, analiza różnorodności i porównywanie próbek.

Zastosowanie Amplicon Seq

1. Mikrobiomika: Analiza struktury i różnorodności mikrobiomów w różnych środowiskach (np. jelitowym, glebowym, wodnym).
2. Diagnostyka medyczna: Identyfikacja patogenów w próbkach biologicznych.
3. Ekologia molekularna: Badanie bioróżnorodności i dynamiki ekosystemów.
4. Bezpieczeństwo żywności: Wykrywanie kontaminantów mikrobiologicznych.
5. Badania ewolucyjne: Identyfikacja i śledzenie genów markerowych.

Amplicon sequencing jest popularny dzięki precyzji, stosunkowo niskim kosztom i możliwości jednoczesnego analizowania wielu próbek.

Charakterystyka techniczna usługi Amplicon Seq. – Illumina

• Tryb sekwencjonowania: 2x250bp
• Standardowa do wyboru ilość danych na próbkę:
  • 30k par odczytów (tags)
  • 50k par odczytów (tags) – standardowe, rekomendowane podejście
  • 100k par odczytów (tags)
  • Inna / Niestandardowa (na specjalne życzenie klienta).
• Dostępne opcje wyboru regionu do amplifikacji:
  • 16S – identyfikacja bakterii:
    • V3+V4 – standardowe podejście. Proponowane startery: 338F i 806R
    • V4+V5 – proponowane startery: 515F i 926R
    • V4 – proponowane startery: 515F i 806R2
    • Archea V3+V4 – proponowane startery: Arch349F i Arch806R
  • ITS – identyfikacja grzybów:
    • ITS1 – standardowe podejście. Proponowane startery: ITS1F i ITS2
    • ITS2 – Proponowane startery: ITS2F i ITS2R.
  • 18S – identyfikacja eukariotycznego rRNA:
    • V4 – Proponowane startery: TAReuk454FWD1 i TAReukREV3
    • V7 – Proponowane startery: 960F i NSR1438

• Rekomendowane wymagania dotyczące próbek (Illumina):
  • Typ próbki: gDNA
  • Ilość: > 500ng
  • Koncentracja (NanoDrop): >20 ng/μL
  • Objętość: >20 μL
  • Czystość (OD260/280): 1.6 – 2.5
• MINIMALNE wymagania dotyczące próbek (Illumina):
  • Typ próbki: gDNA
  • Ilość: > 300ng
  • Koncentracja (Qubit): >1 ng/μL
  • Objętość: >20 μL

Możliwa jest również izolacja DNA z dostarczonych próbek. Szczegóły tutaj.

Charakterystyka techniczna usługi Amplicon Seq. – PacBio

• Długie odczyty, HiFi
• Standardowa do wyboru ilość danych na próbkę:
  • 10k par odczytów (tags)
  • 30k par odczytów (tags)
  • 50k par odczytów (tags)
  • Inna / niestandardowa (na specjalne życzenie klienta).
• Dostępne opcje wyboru regionu do amplifikacji:
  • 16S (cały fragment ok. 1.5 Kb długości, od V1 do V9). Proponowane startery: 27F i 1492R
  • ITS (cały frament ok. 0.5-0.7 Kb długości, od ITS1 do ITS2). Proponowane startery: ITS1 i ITS4
  • 18S (cały fragment ok. 1.8 Kb długośc). Proponowane startery: Euk-A i Euk-B
• Rekomendowane wymagania dotyczące próbek (Pac-Bio):
  • Typ próbki: gDNA
  • Ilość: > 1500ng
  • Koncentracja (NanoDrop): >50 ng/μL
  • Objętość: >20 μL
  • Czystość (OD260/280): 1.6 – 2.5
• MINIMALNE wymagania dotyczące próbek (Pac-Bio):
  • Typ próbki: gDNA
  • Ilość: > 1000ng
  • Koncentracja (Qubit): >20 ng/μL
  • Objętość: >20 μL

Możliwa jest również izolacja DNA z dostarczonych próbek. Szczegóły tutaj.

Analiza Bioinformatyczna

Zaawansowana analiza bioinformatyczna w pakiecie Amplicon Seq. obejmuje m.in.:

• Analiza OTU/ASV
• Adnotacja taksonomiczna i względna obfitość
• Analiza różnorodności alfa
• Analiza różnorodności beta
• Analiza różnicowa między grupami
• Analiza korelacji
• Predykcja genów funkcjonalnych 16S / ITS / 18S