RNA-seq

mRNA-seq, czyli sekwencjonowanie RNA skierowane na mRNA, to technika oparta na sekwencjonowaniu nowej generacji (NGS), która pozwala na badanie transkryptomu - zbioru mRNA obecnego w danej komórce lub tkance w określonym momencie. Metoda ta umożliwia uzyskanie globalnego obrazu ekspresji genów, w tym ilościowe i jakościowe informacje o mRNA.

Przebieg procesu RNA-seq

Zastosowanie RNA-seq

Charakterystyka techniczna mRNA-seq (polyA)

• Sposób przygotowania bibliotek: wyodrębnienie mRNA zawierającego ogony poli(A) z całkowitego RNA poprzez zastosowanie magnetycznych kuleczek pokrytych oligo(dT), które wiążą poli(A) znajdującego się na końcach mRNA. Całkowity (total) RNA miesza się z kulkami, a po związaniu poli(A)-mRNA pozostałe rodzaje RNA (rRNA, tRNA) są usuwane przez płukanie.
• Opcje przygotowania bibliotek:
  • Stranded - przygotowanie biblioteki z określeniem kierunkowości. Oznacza to, że podczas przygotowywania próbki zachowuje się informację o kierunku transkrypcji RNA, co pozwala określić, z której nici DNA pochodzi dany transkrypt.
  • Non-stranded - przygotowanie biblioteki bez określenia kierunkowości. W tym przypadku informacja o kierunku transkrypcji RNA nie jest zachowywana, co skutkuje utratą danych o orientacji nici.
• Tryb sekwencjonowania: 2x150 bp
• Sekwenatory: platforma Illumina, sekwenatory NovaSeq 6000 oraz NovaSeq X.
• Rekomendowana ilość danych na próbkę:
  • 6 Gb na próbkę
  • 10 Gb na próbkę
  • 15 Gb na próbkę
  • Dostępne są również inne konfiguracje w zależności od potrzeb klienta.
• Jakość danych: Q30 ≥ 85%
• Rekomendowane wymagania dotyczące próbek:
  • Typ próbki: total RNA
  • Ilość: > 0.5 μg
  • Koncentracja (NanoDrop): >50 ng/μL
  • Objętość: >20 μL
  • Czystość (OD260/280): 1.8 - 2.2
  • RIN: >7 (> 6 rośliny)
• MINIMALNE wymagania dotyczące próbek:
  • Typ próbki: total RNA
  • Ilość: > 0,2 μg
  • Koncentracja (Qubit): >20 ng/μL
  • Objętość: >20 μL
  • Czystość (OD260/280): 1.7 - 2.5
  • RIN: >4.5 (> 4 rośliny)
  • 5.0 ≥ 28S/18S ≥ 1.0
• Możliwa jest również izolacja RNA z dostarczonych próbek. Szczegóły tutaj.

Analiza bioinformatyczna mRNA-seq (polyA)

Zaawansowana analiza bioinformatyczna w pakiecie mRNA-seq obejmuje m.in.:

• Kontrola jakości danych
• Alignment do genomu referencyjnego
• Kontrola jakości bibliotek
• Analiza SNP/InDel
• Optymalizacja struktury genów
• Analiza nowych genów
• Kwantyfikacja ekspresji genów
• Analiza różnicowej ekspresji (DEG)
• Funkcjonalna anotacja DEGs i analiza wzbogacenia
• Analiza różnicowego splicingu alternatywnego
• Analiza wzbogacenia zestawu genów (GSEA)
• Różnicowe wykorzystanie eksonów (DEU)

Przykładowe wykresy z raportu analizy bioinformatycznej

Charakterystyka techniczna RNA-seq (deplecja rRNA)

• Sposób przygotowania bibliotek: usuwanie rybosomalnego RNA z próbki które może stanowić nawet 90% RNA pozwala na zachowanie do analizy frakcji mRNA, lncRNA, circRNA oraz small RNA.
• Tryb sekwencjonowania: 2x150 bp
• Sekwenatory: platforma Illumina, sekwenatory NovaSeq 6000 oraz NovaSeq X.
• Rekomendowana ilość danych na próbkę:
  • 12 Gb na próbkę
  • 16 Gb na próbkę (to minimalna ilość jaka pozwala na analizę również circRNA)
  • Dostępne są również inne konfiguracje w zależności od potrzeb klienta.
• Jakość danych: Q30 ≥ 85%
• Rekomendowane wymagania dotyczące próbek:
  • Typ próbki: total RNA
  • Ilość: > 2000 ng
  • Koncentracja (NanoDrop): >100 ng/μL
  • Objętość: >10 μL
  • Czystość (OD260/280): 1.8 - 2.2
  • RIN: >7 (> 6 rośliny)
• MINIMALNE wymagania dotyczące próbek:
  • Typ próbki: total RNA
  • Ilość: > 500 ng
  • Koncentracja (Qubit): >80 ng/μL
  • Objętość: >10 μL
  • Czystość (OD260/280): 1.7 - 2.5
  • RIN: >6.5 (> 6 rośliny)
  • 5.0 ≥ 28S/18S ≥ 1.0
• Możliwa jest również izolacja DNA z dostarczonych próbek. Szczegóły tutaj.

Analiza bioinformatyczna RNA-seq (deplecja rRNA)

Zaawansowana analiza bioinformatyczna w pakiecie RNA-seq obejmuje:

• Analizę typów transkryptów w celu zidentyfikowania mRNA i lncRNA.
• Badanie wzajemnych powiązań i współzależności między lncRNA a mRNA.
• Ocenę organizacji genów, w tym granic intronów i eksonów, alternatywnego składania oraz nowo odkrytych genów.
• Pomiar poziomów ekspresji lncRNA i mRNA w próbkach.
• Identyfikację genów (DEG) i lncRNA (DE-lncRNA) różnicowo eksprymowanych między próbkami lub grupami.
• Przypisanie funkcji różnicowo eksprymowanym genom (DEG) i różnicowo eksprymowanym lncRNA (DE-lncRNA), a także identyfikacja ścieżek biologicznych i procesów, w które są zaangażowane.
• Identyfikację genów docelowych regulowanych przez lncRNA oraz analiza ich potencjalnych funkcji.
• Badanie potencjalnych interakcji białkowych związanych z lncRNA różnicowo eksprymowanymi.
• Ocenę konserwatyzmu sekwencji lncRNA w różnych gatunkach, co pozwala określić ich potencjalną istotność biologiczną.
• Przegląd i klasyfikacja wcześniej zidentyfikowanych lncRNA.
• Identyfikację potencjalnych prekursorów miRNA na podstawie sekwencji lncRNA.
• Identyfikację genów docelowych regulowanych przez miRNA i badanie ich funkcji w procesach biologicznych.