RNA-seq

mRNA-seq, czyli sekwencjonowanie RNA skierowane na mRNA, to technika oparta na sekwencjonowaniu nowej generacji (NGS), która pozwala na badanie transkryptomu – zbioru mRNA obecnego w danej komórce lub tkance w określonym momencie. Metoda ta umożliwia uzyskanie globalnego obrazu ekspresji genów, w tym ilościowe i jakościowe informacje o mRNA.

Przebieg procesu RNAseq

1. Izolacja RNA: W pierwszym kroku izoluje się całkowite RNA z próbki biologicznej. Następnie, selektywnie poprzez polyA enrichment lub usuwanie rybosomalnego RNA (rRNA), otrzymuje się próbkę zawierającą mRNA.
2. Tworzenie bibliotek cDNA: mRNA przekształca się w komplementarne DNA (cDNA) za pomocą odwrotnej transkryptazy.
3. Sekwencjonowanie: cDNA jest fragmentowane, oznaczane i sekwencjonowane przy użyciu platformy Illumina.
4. Analiza bioinformatyczna: Wyniki sekwencjonowania są analizowane, co pozwala na identyfikację genów, poziomów ich ekspresji, a także wykrywanie nowych transkryptów, izoform lub mutacji.

Zastosowanie RNAseq

1. Biologia molekularna i genomika:
   • Identyfikacja wzorów ekspresji genów w różnych warunkach biologicznych (np. porównanie zdrowych i chorobowych tkanek; porównanie osobników traktowanych i nietraktowanych badanym czynnikiem).
   • Odkrywanie nowych genów, alternatywnych izoform oraz genów regulatorowych.
2. Badania medyczne:
   • Onkologia: Analiza transkryptomu nowotworów w celu identyfikacji biomarkerów diagnostycznych, prognostycznych lub terapeutycznych.
   • Choroby genetyczne: Zrozumienie mechanizmów molekularnych chorób dziedzicznych.
3. Farmakologia:
   • Identyfikacja celów dla nowych leków.
   • Monitorowanie efektów działania leków na poziomie ekspresji genów.
   • Badanie aktywacji i funkcji komórek układu odpornościowego, np. limfocytów T i B.
4. Biotechnologia i rolnictwo:
   • Zrozumienie procesów wzrostu i adaptacji roślin oraz mikroorganizmów.
   • Poprawa cech użytkowych roślin lub mikroorganizmów przemysłowych.

Charakterystyka techniczna usługi mRNAseq (polyA)

• Sposób przygotowania bibliotek: wyodrębnienie mRNA zawierającego ogony poli(A) z całkowitego RNA poprzez zastosowanie magnetycznych kuleczek pokrytych oligo(dT), które wiążą poli(A) znajdującego się na końcach mRNA. Całkowity (total) RNA miesza się z kulkami, a po związaniu poli(A)-mRNA pozostałe rodzaje RNA (rRNA, tRNA) są usuwane przez płukanie.
• Opcje przygotowania bibliotek:
  • Stranded  – przygotowanie biblioteki z określeniem kierunkowości. Oznacza to, że podczas przygotowywania próbki zachowuje się informację o kierunku transkrypcji RNA, co pozwala określić, z której nici DNA pochodzi dany transkrypt.
  • Non stranded –  przygotowanie biblioteki bez określenia kierunkowości. W tym przypadku informacja o kierunku transkrypcji RNA nie jest zachowywana, co skutkuje utratą danych o orientacji nici.
• Tryb sekwencjonowania: 2x150bp
• Sekwenatory: platforma Illumina, sekwenatory NovaSeq 6000 oraz NovaSeq X.
• Rekomendowana ilość danych na próbkę:
  • 6 Gb na próbkę
  • 10Gb na próbkę
  • 15Gb na próbkę
  • Dostępne są również inne konfiguracje w zależności od potrzeb klienta.
• Jakość danych: Q30 ≥ 85%
• Rekomendowane wymagania dotyczące próbek:
  • Typ próbki: total RNA
  • Ilość: > 2000ng
  • Koncentracja (NanoDrop): >50 ng/μL
  • Objętość: >10 μL
  • Czystość (OD260/280): 1.8 – 2.2
  • RIN: >7 (> 6 rośliny)
• MINIMALNE wymagania dotyczące próbek:
  • Typ próbki: total RNA
  • Ilość: > 500ng
  • Koncentracja (Qubit): >20 ng/μL
  • Objętość: >10 μL
  • Czystość (OD260/280): 1.7 – 2.5
  • RIN: >6.5 (> 6 rośliny)
  • 5.0 ≥ 28S/18S ≥ 1.0
• Możliwa jest również izolacja DNA z dostarczonych próbek. Szczegóły tutaj.

Analiza Bioinformatyczna mRNAseq (polyA)

Zaawansowana analiza bioinformatyczna w pakiecie mRNAseq. obejmuje m.in.:

• Kontrola jakości danych
• Aligment do genomu referencyjnego
• Kontrola jakości bibliotek
• Analiza SNP/InDel
• Optymalizacja struktury genów
• Analiza nowych genów
• Kwantyfikacja ekspresji genów
• Analiza różnicowej ekspresji (DEG)
• Funkcjonalna anotacja DEGs i analiza wzbogacenia
• Analiza różnicowego splicingu alternatywnego
• Analiza wzbogacenia zestawu genów (GSEA)
• Różnicowe wykorzystanie eksonów (DEU)

Przykładowe wykresy z raportu analizy bioinformatycznej:

Charakterystyka techniczna usługi RNAseq (deplecja rRNA)

• Sposób przygotowania bibliotek: usuwanie rybosomalnego RNA z próbki które może stanowić nawet 90% RNA pozwala na zachowanie do analizy frakcji mRNA, lncRNA, circRNA oraz small RNA.
• Tryb sekwencjonowania: 2x150bp
• Sekwenatory: platforma Illumina, sekwenatory NovaSeq 6000 oraz NovaSeq X.
• Rekomendowana ilość danych na próbkę:
  • 12 Gb na próbkę
  • 16Gb na próbkę (to minimalna ilość jaka pozwala na analizę również circRNA)
  • Dostępne są również inne konfiguracje w zależności od potrzeb klienta.
• Jakość danych: Q30 ≥ 85%
• Rekomendowane wymagania dotyczące próbek:
  • Typ próbki: total RNA
  • Ilość: > 2000ng
  • Koncentracja (NanoDrop): >100 ng/μL
  • Objętość: >10 μL
  • Czystość (OD260/280): 1.8 – 2.2
  • RIN: >7 (> 6 rośliny)
• MINIMALNE wymagania dotyczące próbek:
  • Typ próbki: total RNA
  • Ilość: > 500ng
  • Koncentracja (Qubit): >80 ng/μL
  • Objętość: >10 μL
  • Czystość (OD260/280): 1.7 – 2.5
  • RIN: >6.5 (> 6 rośliny)
  • 5.0 ≥ 28S/18S ≥ 1.0
• Możliwa jest również izolacja DNA z dostarczonych próbek. Szczegóły tutaj.

Analiza Bioinformatyczna RNAseq (deplecja rRNA)

Zaawansowana analiza bioinformatyczna w pakiecie RNAseq obejmuje:

• Analizę typów transkryptów w celu zidentyfikowania mRNA i lncRNA.
• Badanie wzajemnych powiązań i współzależności między lncRNA a mRNA.
• Ocenę organizacji genów, w tym granic intronów i eksonów, alternatywnego składania oraz nowo odkrytych genów.
• Pomiar poziomów ekspresji lncRNA i mRNA w próbkach.
• Identyfikację genów (DEG) i lncRNA (DE-lncRNA) różnicowo eksprymowanych między próbkami lub grupami.
• Przypisanie funkcji różnicowo eksprymowanym genom (DEG) i różnicowo eksprymowanym lncRNA (DE-lncRNA), a także identyfikacja ścieżek biologicznych i procesów, w które są zaangażowane.
• Identyfikację genów docelowych regulowanych przez lncRNA oraz analiza ich potencjalnych funkcji.
• Badanie potencjalnych interakcji białkowych związanych z lncRNA różnicowo eksprymowanymi.
• Ocenę konserwatyzmu sekwencji lncRNA w różnych gatunkach, co pozwala określić ich potencjalną istotność biologiczną.
• Przegląd i klasyfikacja wcześniej zidentyfikowanych lncRNA.
• Identyfikację potencjalnych prekursorów miRNA na podstawie sekwencji lncRNA.
• Identyfikację genów docelowych regulowanych przez miRNA i badanie ich funkcji w procesach biologicznych.