Small RNAseq

Small RNA-seq (ang. small RNA sequencing) to technika służąca do identyfikacji i analizy małych cząsteczek RNA (o długości zwykle 18–30 nukleotydów), takich jak mikroRNA (miRNA), małe interferujące RNA (siRNA) czy piRNA (ang. piwi interacting).

Przebieg procesu small RNAseq

1. Izolacja małych RNA: Izolacja RNA z próbek z selekcją frakcji małych RNA.
2. Przygotowanie bibliotek: Dodanie specyficznych adapterów do końców małych RNA, umożliwiających ich amplifikację i sekwencjonowanie.
3. Sekwencjonowanie: Wykorzystanie technologii wysokoprzepustowych, takich jak Illumina.
4. Analiza bioinformatyczna: Identyfikacja i kwantyfikacja poszczególnych cząsteczek RNA, analiza ich funkcji oraz identyfikacja nowo odkrytych małych RNA.

Zastosowanie small RNAseq:

• Badanie regulacji genów: Analiza miRNA, które regulują ekspresję genów na poziomie post-transkrypcyjnym.
• Biomarkery chorób: Identyfikacja wzorców małych RNA specyficznych dla chorób, np. raka, cukrzycy czy chorób neurodegeneracyjnych.
• Badania mechanizmów odpornościowych: Charakterystyka RNA wirusów lub siRNA w odpowiedzi na infekcje.
• Odkrywanie nowych małych RNA: Poszerzanie wiedzy o małych RNA o nieznanej dotąd funkcji.

Technika ta pozwala lepiej zrozumieć rolę małych RNA w biologii komórki i ich potencjalne zastosowania terapeutyczne.

Charakterystyka techniczna small RNAseq

• Sposób przygotowania bibliotek: usunięcie rybosomalnego RNA z próbki, a następnie wyselekcjonowanie frakcji krótkich RNA.
• Tryb sekwencjonowania: 1x50bp (SE50)
• Sekwenatory: platformy Illumina
• Rekomendowana ilość danych na próbkę:
  • 10M odczytów na próbkę
  • 20M odczytów na próbkę
  • Dostępne są również inne konfiguracje w zależności od potrzeb klienta.
• Jakość danych: Q30 ≥ 85%
• Rekomendowane wymagania dotyczące próbek:
  • Typ próbki: total RNA z frakcją małych RNA
  • Ilość: > 2000ng
  • Koncentracja (NanoDrop): >100 ng/μL
  • Objętość: >10 μL
  • Czystość (OD260/280): 1.8 – 2.2
  • RIN: >7
• MINIMALNE wymagania dotyczące próbek:
  • Typ próbki: total RNA
  • Ilość: > 500ng
  • Koncentracja (Qubit): >80 ng/μL
  • Objętość: >10 μL
  • Czystość (OD260/280): 1.7 – 2.5
  • RIN: >6.5
  • 5.0 ≥ 28S/18S ≥ 1.0

Możliwa jest również izolacja DNA z dostarczonych próbek. Szczegóły tutaj.

Analiza Bioinformatyczna small RNAseq

Zaawansowana analiza bioinformatyczna w pakiecie small RNAseq. obejmuje m.in.:

• Kontrolę jakości danych po sekwencjonowaniu
• Adnotacja ncRNA i powtarzających się sekwencji oraz mapowanie do genomu referencyjnego
• Identyfikacja miRNA znanych i nowych
• Zaproponowanie prekursorów nowych miRNA przez miRDeep2
• Rozkład ekspresji miRNA
• Identyfikacja i adnotacja genów docelowych miRNA
• Adnotacja KEGG genów targetowych cząsteczek miRNA o zróżnicowanej ekspresji