Do standardowej analizy różnicowej ekspresji genów w mRNA-seq najczęściej wystarcza około 20-30 mln par odczytów na próbkę. Większa głębokość może być potrzebna przy analizie słabo eksprymowanych genów, nowych transkryptów, alternatywnego splicingu, materiału mieszanego lub bibliotek Total RNA-seq.
Nie ma jednak jednej właściwej wartości dla każdego projektu. Sequencing depth należy dobrać do celu analizy, rodzaju biblioteki, złożoności transkryptomu, jakości materiału i liczby replik biologicznych.
Porównanie wariantów głębokości RNA-seq
Poniższe wartości dotyczą bibliotek paired-end 2 × 150 bp.
| Ilość danych | Liczba pojedynczych odczytów | Liczba par odczytów | Typowe zastosowanie |
|---|---|---|---|
| 3 Gb | około 20 mln | około 10 mln | Podstawowe profilowanie silnie eksprymowanych genów |
| 6 Gb | około 40 mln | około 20 mln | Standardowa analiza DEG w mRNA-seq |
| 10 Gb | około 66 mln | około 33 mln | Pogłębiona analiza ekspresji i słabiej eksprymowanych genów |
| 12 Gb | około 80 mln | około 40 mln | Standardowy Total RNA-seq z deplecją rRNA |
| 15 Gb | około 100 mln | około 50 mln | Splicing, izoformy, nowe transkrypty i złożone próbki |
| 16 Gb | około 106 mln | około 53 mln | Total RNA-seq, w tym projekty obejmujące circRNA |
| Powyżej 16 Gb | Ponad 106 mln | Ponad 53 mln | Szczególnie złożone transkryptomy i specjalistyczne cele |
Są to wartości orientacyjne. Rzeczywista liczba użytecznych odczytów zależy od jakości sekwencjonowania, skuteczności usunięcia rRNA, odsetka duplikatów oraz liczby odczytów mapujących się jednoznacznie do genomu lub transkryptomu.
Odczyty czy pary odczytów?
W projektach paired-end każdy fragment biblioteki jest odczytywany z dwóch stron. Sekwencjonowanie 20 mln fragmentów w trybie 2 × 150 bp generuje zatem:
- 20 mln par odczytów,
- 40 mln pojedynczych odczytów,
- około 6 Gb surowych danych.
Dlatego określenie „40 mln reads” może oznaczać 40 mln pojedynczych odczytów albo 40 mln par. W opisie projektu do wyceny należy zawsze wskazać, czy wartość dotyczy pojedynczych odczytów, par odczytów czy całkowitej liczby zasad.
Kiedy wybrać 6 Gb - około 20 mln par odczytów?
Wariant 6 Gb będzie odpowiedni, gdy:
- wykonujesz standardowy mRNA-seq z selekcją Poly(A),
- głównym celem jest analiza różnicowej ekspresji genów,
- badany organizm ma dobrej jakości genom i adnotację,
- próbki pochodzą z jednorodnej tkanki lub populacji komórek,
- RNA jest dobrej jakości,
- nie planujesz rozbudowanej analizy nowych izoform,
- analizowane geny nie są skrajnie słabo eksprymowane.
Jest to często wystarczający wariant dla standardowych eksperymentów porównujących ekspresję genów pomiędzy warunkami, tkankami, genotypami lub punktami czasowymi.
Kiedy wybrać 10 Gb - około 33 mln par odczytów?
Wariant 10 Gb warto rozważyć, gdy:
- zależy Ci na większej czułości wykrywania słabo eksprymowanych genów,
- analizujesz bardziej złożony transkryptom,
- materiał obejmuje kilka typów komórek,
- planowana jest analiza alternatywnego splicingu,
- oczekujesz umiarkowanie dużych różnic w ekspresji,
- genom lub jego adnotacja nie są kompletne,
- chcesz zachować większy margines na odrzucenie odczytów podczas kontroli jakości.
Ten wariant stanowi rozsądny kompromis pomiędzy kosztem a zakresem informacji w bardziej wymagających projektach mRNA-seq.
Kiedy wybrać 15 Gb - około 50 mln par odczytów?
Wariant 15 Gb będzie uzasadniony, gdy:
- planujesz analizę nowych transkryptów i izoform,
- interesuje Cię różnicowe wykorzystanie eksonów,
- analizujesz złożony alternatywny splicing,
- poszukujesz słabo eksprymowanych transkryptów,
- próbki są heterogeniczne,
- transkryptom badanego organizmu jest duży lub słabo opisany,
- istotna jest analiza wariantów na podstawie danych RNA-seq,
- spodziewasz się niższego odsetka użytecznych odczytów.
Większa ilość danych nie gwarantuje jednak wykrycia wszystkich transkryptów. Ograniczeniem może być złożoność biblioteki, jakość RNA lub bardzo niska ekspresja.
Kiedy wybrać 12-16 Gb dla Total RNA-seq?
Total RNA-seq z deplecją rRNA wymaga zwykle większej ilości danych niż mRNA-seq z selekcją Poly(A). Po usunięciu rRNA biblioteka nadal zawiera różne rodzaje RNA, w tym mRNA, lncRNA, transkrypty antysensowne, pre-mRNA oraz inne RNA niekodujące.
Wybierz około 12 Gb na próbkę, jeśli:
- wykonujesz standardowy Total RNA-seq,
- analizujesz mRNA i lncRNA,
- interesują Cię transkrypty bez ogona poli(A),
- skuteczność deplecji rRNA powinna być wysoka.
Wybierz około 16 Gb lub więcej, jeśli:
- projekt obejmuje analizę circRNA,
- poszukujesz rzadkich transkryptów niekodujących,
- materiał jest bardzo złożony,
- spodziewasz się wysokiego udziału pozostałości rRNA,
- próbka zawiera RNA kilku organizmów.
Do analizy dojrzałych miRNA i innych bardzo krótkich RNA należy zastosować osobny protokół small RNA-seq.
Kiedy większa głębokość nie rozwiąże problemu?
Dodatkowe odczyty pomagają tylko wtedy, gdy biblioteka zawiera wystarczająco dużo różnych cząsteczek. Jeśli biblioteka ma niską złożoność, dalsze sekwencjonowanie będzie generować głównie duplikaty.
Dotyczy to szczególnie:
- próbek low-input,
- RNA silnie zdegradowanego,
- bibliotek poddanych intensywnej amplifikacji PCR,
- materiału o bardzo małej liczbie komórek,
- próbek z nieskuteczną deplecją rRNA,
- bibliotek o nieprawidłowym rozkładzie długości fragmentów.
W takich przypadkach jakość materiału i sposób przygotowania biblioteki są ważniejsze niż samo zwiększenie liczby odczytów.
Replikaty czy większa liczba odczytów?
W analizie różnicowej ekspresji liczba niezależnych replik biologicznych ma często większe znaczenie niż bardzo głębokie sekwencjonowanie niewielkiej liczby próbek.
Jeśli budżet jest ograniczony, zwykle lepiej:
- uwzględnić co najmniej trzy niezależne replikaty biologiczne w grupie,
- zastosować umiarkowaną, ale wystarczającą głębokość,
- zachować zrównoważony projekt eksperymentu,
- unikać łączenia grupy biologicznej z konkretną partią przygotowania bibliotek lub sekwencjonowania.
Zwiększenie głębokości tej samej próbki nie zastępuje replikacji biologicznej i nie pozwala oszacować zmienności pomiędzy osobnikami.
Wymagania dotyczące próbek
mRNA-seq z selekcją Poly(A)
Rekomendowane parametry:
- materiał: total RNA,
- ilość: powyżej 0,5 µg,
- stężenie: powyżej 50 ng/µl,
- objętość: powyżej 20 µl,
- OD260/280: 1,8-2,2,
- RIN: powyżej 7, a dla roślin powyżej 6.
Minimalne parametry:
- ilość: powyżej 0,2 µg,
- stężenie Qubit: powyżej 20 ng/µl,
- objętość: powyżej 20 µl,
- OD260/280: 1,7-2,5,
- RIN: powyżej 4,5, a dla roślin powyżej 4.
Total RNA-seq z deplecją rRNA
Rekomendowane parametry:
- materiał: total RNA,
- ilość: powyżej 2 µg,
- stężenie: powyżej 100 ng/µl,
- objętość: powyżej 10 µl,
- OD260/280: 1,8-2,2,
- RIN: powyżej 7, a dla roślin powyżej 6.
W projektach low-input, próbkach po FACS, materiale FFPE lub RNA niespełniającym standardowych wymagań parametry należy ocenić indywidualnie. Niższa ilość RNA może wymagać zmiany protokołu, ale nie zawsze oznacza, że należy zwiększyć głębokość sekwencjonowania.
Co wpływa na potrzebną liczbę odczytów?
Typowe błędy przy planowaniu sequencing depth
Pytania do planowania projektu
Przed doborem ilości danych zastanów się nad pytaniami:
Zaplanuj projekt
Opisz projekt - dobierzemy metodę i ilość danych.
Na podstawie rodzaju biblioteki, badanego organizmu, jakości RNA i planowanego zakresu analizy pomożemy określić liczbę odczytów potrzebną dla każdej próbki. Dobierzemy również sposób przygotowania biblioteki, tryb sekwencjonowania oraz zakres analizy bioinformatycznej.
Wybrane realizacje i publikacje naszych klientów
Sprawdź, dla jakich instytucji wykonujemy sekwencjonowanie NGS i w jakich publikacjach wykorzystano dostarczone przez nas dane.