Metatranskryptomika analizuje RNA społeczności mikroorganizmów i pozwala sprawdzić, które geny ulegają ekspresji w badanych warunkach. Wybierz ją, gdy chcesz ocenić odpowiedź mikrobiomu na zmianę środowiska, dietę lub zastosowane traktowanie. Jeżeli interesuje Cię przede wszystkim skład mikrobiomu oraz obecność genów o określonych funkcjach, odpowiedniejsza będzie metagenomika shotgun.
Metatranskryptomika a metagenomika shotgun
| Cecha | Metatranskryptomika | Metagenomika shotgun |
|---|---|---|
| Materiał | RNA przepisane na cDNA | DNA |
| Główne pytanie | Które geny ulegają ekspresji? | Jakie mikroorganizmy i geny są obecne? |
| Informacja o funkcjach | Ekspresja genów i przypisanie ich do funkcji oraz szlaków | Potencjał funkcjonalny zapisany w genach |
| Ograniczenie | Poziom RNA nie jest bezpośrednim pomiarem aktywności enzymów | Obecność genu nie potwierdza jego ekspresji |
Co wybrać?
Wybierz metatranskryptomikę, gdy planujesz porównać ekspresję genów mikrobiomu między grupami, warunkami lub punktami czasowymi. Analiza może obejmować składanie transkryptów, przypisanie taksonomiczne, adnotację funkcjonalną i analizę różnic między grupami, m.in. z wykorzystaniem GO, KEGG, eggNOG, CAZy lub CARD.
Wybierz metagenomikę shotgun, gdy chcesz określić skład społeczności oraz wykryć geny związane np. z metabolizmem lub opornością na antybiotyki.
Obie metody można połączyć dla tych samych próbek. Dane DNA pomagają interpretować, czy zmiana sygnału RNA wiąże się ze zmianą ekspresji, czy ze zmianą udziału danego mikroorganizmu w społeczności.
Wymagania dotyczące próbki
Punktem wyjścia jest całkowite RNA. Przygotowanie bibliotek obejmuje usuwanie rRNA i budowę bibliotek kierunkowych. Orientacyjne wymagania dla wyizolowanego RNA przedstawiono poniżej.
| Parametr | Wymaganie |
|---|---|
| Ilość całkowita | ≥1 µg |
| Stężenie | ≥50 ng/µl |
| Objętość | ≥20 µl |
| Integralność | RIN ≥6,5 |
| Czystość A260/A280 | 1,8-2,0 |
| Czystość A260/A230 | 1,0-2,5 |
Ilość materiału biologicznego potrzebną do izolacji ustalamy zależnie od typu próbki. Sposób pobrania, zabezpieczenia i transportu warto uzgodnić przed rozpoczęciem eksperymentu. Materiał należy szybko zabezpieczyć przed degradacją RNA, stosując jednakową procedurę we wszystkich grupach.
Orientacyjna ilość danych
Rekomendowaną ilością danych jest 12 Gb danych na próbkę w trybie Illumina PE150, czyli 2 × 150 nukleotydów. Odpowiada to około 40 mln par odczytów, czyli 80 mln pojedynczych odczytów o pełnej długości.
Docelową ilość danych dobieramy do złożoności mikrobiomu, udziału RNA gospodarza i celu analizy. Po odfiltrowaniu rRNA, sekwencji gospodarza i odczytów niskiej jakości danych użytecznych będzie mniej. W wycenie należy doprecyzować, czy podana ilość dotyczy danych surowych, czy po filtracji.
Typowe błędy
Pytania do przygotowania planu projektu
Opisz projekt - dobierzemy metodę i ilość danych.
Wybrane realizacje i publikacje naszych klientów
Sprawdź, dla jakich instytucji wykonujemy sekwencjonowanie NGS i w jakich publikacjach wykorzystano dostarczone przez nas dane.