Whole Exome Sequencing, czyli sekwencjonowanie całego eksomu, to metoda umożliwiająca analizę regionów kodujących białka, eksonów oraz przylegających do nich sekwencji istotnych dla prawidłowego składania transkryptów.
Eksony stanowią około 1-2% ludzkiego genomu, ale obejmują znaczną część wariantów bezpośrednio wpływających na budowę i funkcję białek. Dzięki ukierunkowaniu sekwencjonowania na regiony kodujące WES pozwala uzyskać wysokie pokrycie badanego obszaru przy mniejszej ilości danych niż w przypadku sekwencjonowania całego genomu.
Technika jest wykorzystywana przede wszystkim do identyfikacji wariantów germinalnych i somatycznych związanych z chorobami dziedzicznymi, chorobami rzadkimi oraz procesami nowotworowymi.
Przebieg procesu WES
Zastosowanie WES
Dostępne warianty usługi WES
Dostępne strategie Exone Capture:
- Agilent SureSelectXT Human All Exon V6 + UTR + mtDNA
- Agilent SureSelectXT Human All Exon V6 + UTR + mtDNA (with UMI)
- IDT xGen Exome Hyb Panel V2
- Standardowy wariant jest przeznaczony przede wszystkim do identyfikacji wariantów germinalnych, takich jak:
- SNV, czyli zmiany pojedynczych nukleotydów,
- małe insercje i delecje (InDele),
- warianty wpływające na sekwencję kodującą lub miejsca składania RNA.
- WES z wykorzystaniem UMI. UMI, czyli Unique Molecular Identifiers, to krótkie, unikalne sekwencje dołączane do cząsteczek DNA podczas przygotowania biblioteki. Pozwalają one odróżnić niezależne cząsteczki DNA od kopii powstałych w wyniku amplifikacji PCR.
Zastosowanie UMI umożliwia:
- dokładniejsze usuwanie duplikatów PCR,
- ograniczenie liczby artefaktów technicznych,
- tworzenie sekwencji konsensusowych,
- zwiększenie wiarygodności identyfikacji wariantów występujących z niską częstością allelu,
- dokładniejszą analizę próbek o ograniczonej ilości DNA lub wymagających wysokiej głębokości sekwencjonowania.
Charakterystyka techniczna WES
Rekomendowane pokrycie i ilość danych (output)
Wymagana ilość danych zależy od celu projektu, jakości materiału, zastosowanego panelu oraz oczekiwanej czułości identyfikacji wariantów.
- około 5 Gb danych na próbkę: orientacyjnie około 50× średniego pokrycia,
- około 10 Gb danych na próbkę: orientacyjnie około 100× średniego pokrycia,
- minimum 12 Gb danych na próbkę: analiza wariantów germinalnych wymagająca zwiększonej głębokości,
- minimum 15 Gb danych na próbkę: analiza wariantów somatycznych.
Pokrycie eksomu nie jest całkowicie równomierne. Część regionów może być reprezentowana słabiej ze względu na wysoką lub niską zawartość GC, obecność sekwencji powtarzalnych, podobieństwo do innych fragmentów genomu lub ograniczoną wydajność hybrydyzacji sond.
Dlatego przy ocenie jakości danych analizuje się nie tylko średnią głębokość sekwencjonowania, ale również:
- odsetek odczytów przypisanych do regionów docelowych - on-target,
- udział regionów pokrytych na poziomie co najmniej 10×, 20× lub wyższym,
- równomierność pokrycia,
- rozkład głębokości sekwencjonowania,
- odsetek duplikatów,
- liczbę regionów o niewystarczającym pokryciu.
Wymagania dotyczące próbek
Rekomendujemy przesłanie większej ilości DNA niż wskazane minimum. Pozwala to na powtórzenie kontroli jakości lub przygotowania biblioteki w przypadku wystąpienia problemów technicznych.
Analiza bioinformatyczna WES
Analiza podstawowa
- kontrola jakości danych po sekwencjonowaniu,
- usunięcie adapterów i odczytów niespełniających kryteriów jakości,
- przyrównanie odczytów do genomu referencyjnego,
- ocena wydajności wzbogacenia regionów docelowych,
- analiza średniej głębokości i równomierności pokrycia,
- ocena pokrycia poszczególnych eksonów i genów,
- identyfikacja wariantów SNV,
- identyfikacja małych insercji i delecji,
- filtrowanie i adnotacja wariantów,
- określenie przewidywanego wpływu wariantów na geny i kodowane białka,
- zestawienie wariantów w formie tabelarycznej.
Analiza wariantów germinalnych
Dodatkowo do podstawowej analizy przeprowadzane jest:
- filtrowanie wariantów na podstawie ich częstości w bazach populacyjnych,
- analizę przewidywanego wpływu wariantu na funkcję genu lub białka,
- zestawienie wariantów opisanych w bazach klinicznych i naukowych,
- analizę genów powiązanych z określonym fenotypem,
- analizę modelu dziedziczenia,
- porównanie wariantów pomiędzy członkami rodziny,
- identyfikację wariantów de novo,
- priorytetyzację wariantów kandydujących.
Włączenie informacji o fenotypie, historii rodzinnej oraz przewidywanym sposobie dziedziczenia może istotnie zwiększyć skuteczność interpretacji wyników.
Analiza próbek nowotworowych
W przypadku analizy pary guz i materiał prawidłowy możliwe jest wykonanie:
- identyfikacji i adnotacji wariantów somatycznych,
- identyfikacji wariantów germinalnych,
- analizy częstości allelu wariantowego (VAF),
- analizy spektrum mutacji,
- analizy sygnatur mutacyjnych,
- analizy potencjalnych genów sterujących rozwojem nowotworu,
- analizy często mutowanych genów,
- analizy wzbogacenia szlaków biologicznych,
- przygotowania zestawień i wizualizacji rozmieszczenia wariantów.
Celem poznania cen oferowanych usług zalecamy wypełnienie formularza specyfikacji projektu i/lub zapoznanie się z artykułem dotyczącym wyceny usług.