mRNA-seq z selekcją Poly(A) jest najlepszym wyborem, gdy celem jest analiza ekspresji genów kodujących białka u organizmów eukariotycznych. Total RNA-seq z deplecją rRNA należy wybrać, jeśli projekt obejmuje również lncRNA, transkrypty bez ogona poli(A), circRNA, materiał zdegradowany lub transkryptom organizmów prokariotycznych.
Porównanie metod
| Kryterium | mRNA-seq - Poly(A) | Total RNA-seq - deplecja rRNA |
|---|---|---|
| Sposób wzbogacenia | Selekcja RNA z ogonem poli(A) | Usunięcie rybosomalnego RNA |
| Główna analizowana frakcja | Dojrzałe eukariotyczne mRNA | mRNA i szerszy zakres RNA niekodujących |
| Geny kodujące białka | Tak | Tak |
| lncRNA | Tylko transkrypty z poli(A) | Szerszy zakres |
| Transkrypty bez poli(A) | Zwykle nie | Tak |
| circRNA | Nie | Możliwa analiza w odpowiednim wariancie |
| Dojrzałe miRNA | Nie | Zwykle wymagają osobnego small RNA-seq |
| Materiał zdegradowany | Mniej odpowiedni | Zwykle lepszy wybór |
| Organizmy prokariotyczne | Nie jest standardowo stosowany | Tak, po dobraniu odpowiedniej deplecji rRNA |
| Potrzebna ilość danych | Mniejsza | Większa |
| Koszt | Zwykle niższy | Zwykle wyższy |
Kiedy wybrać mRNA-seq z selekcją Poly(A)?
Wybierz Poly(A), jeśli:
- głównym celem jest analiza ekspresji genów kodujących białka,
- planowana jest analiza różnicowej ekspresji genów (wykrywanie DEG),
- chcesz analizować alternatywny splicing i izoformy mRNA,
- badany materiał pochodzi od organizmu eukariotycznego,
- próbki zawierają RNA o dobrej integralności,
- zależy Ci na wysokim udziale odczytów przypisanych do mRNA.
Selekcja Poly(A) wykorzystuje magnetyczne kuleczki pokryte oligo(dT), które wiążą ogony poli(A) obecne na końcach większości dojrzałych eukariotycznych mRNA. Dzięki temu biblioteka jest wzbogacona w transkrypty kodujące białka.
Kiedy wybrać Total RNA-seq z deplecją rRNA?
Wybierz deplecję rRNA, jeśli:
- potrzebujesz szerokiego obrazu transkryptomu,
- analizujesz zarówno mRNA, jak i lncRNA,
- interesują Cię transkrypty bez ogona poli(A),
- planowana jest analiza circRNA,
- materiał jest częściowo zdegradowany, np. pochodzi z próbek archiwalnych lub FFPE,
- analizujesz transkryptom bakterii albo archeonów,
- próbka zawiera RNA pochodzące od gospodarza i mikroorganizmów.
W tym podejściu z całkowitego RNA usuwane jest rRNA, które może stanowić nawet około 80-90% próbki. Pozostałe frakcje RNA są zachowywane i mogą zostać uwzględnione podczas przygotowania biblioteki.
Wymagania dotyczące próbek
mRNA-seq - Poly(A)
Rekomendowane parametry:
- materiał: total RNA,
- ilość: powyżej 0,5 µg,
- stężenie: powyżej 50 ng/µl,
- objętość: powyżej 20 µl,
- OD260/280: 1,8-2,2,
- RIN: powyżej 7, a dla roślin powyżej 6.
Minimalne parametry:
- ilość: powyżej 0,2 µg,
- stężenie Qubit: powyżej 20 ng/µl,
- objętość: powyżej 20 µl,
- OD260/280: 1,7-2,5,
- RIN: powyżej 4,5, a dla roślin powyżej 4.
Total RNA-seq - deplecja rRNA
Rekomendowane parametry:
- materiał: total RNA,
- ilość: powyżej 2 µg,
- stężenie: powyżej 100 ng/µl,
- objętość: powyżej 10 µl,
- OD260/280: 1,8-2,2,
- RIN: powyżej 7, a dla roślin powyżej 6.
Minimalne parametry:
- ilość: powyżej 500 ng,
- stężenie Qubit: powyżej 80 ng/µl,
- objętość: powyżej 10 µl,
- OD260/280: 1,7-2,5,
- RIN: powyżej 6,5, a dla roślin powyżej 6.
Wymagania mogą się różnić w zależności od organizmu, jakości materiału i wybranego zestawu do przygotowania bibliotek. Próbki niespełniające standardowych kryteriów, w tym materiał low-input, wymagają indywidualnej oceny.
Orientacyjna ilość danych
Dla standardowego mRNA-seq z selekcją Poly(A) dostępne są warianty:
- 6 Gb na próbkę,
- 10 Gb na próbkę,
- 15 Gb na próbkę.
Dla Total RNA-seq z deplecją rRNA rekomendowana ilość danych jest większa:
- 12 Gb na próbkę,
- 16 Gb na próbkę - wariant zalecany, jeśli projekt obejmuje także analizę circRNA.
Ostateczna ilość danych zależy m.in. od wielkości i złożoności transkryptomu, rodzaju materiału, celu analizy oraz oczekiwanej czułości wykrywania słabo eksprymowanych transkryptów.
Typowe błędy przy wyborze metody
Wybór Poly(A) do materiału zdegradowanego
Degradacja może prowadzić do utraty fragmentu 3′ wraz z ogonem poli(A). Takie transkrypty nie zostaną skutecznie wyizolowane, co może powodować ich niedoszacowanie. Z pofragmentowanych cząsteczek wychwytywane są głównie końce 3′ połączone z ogonem poli(A), co zwiększa bias 3′.
Założenie, że Total RNA-seq obejmuje automatycznie miRNA
Standardowy Total RNA-seq nie zastępuje dedykowanego small RNA-seq. Do analizy dojrzałych miRNA i innych krótkich RNA potrzebny jest osobny protokół przygotowania bibliotek - Small RNA-seq.
Wybór Poly(A) do analizy prokariotów
Bakteryjne i archealne mRNA nie posiada stabilnych ogonów poli(A) typowych dla dojrzałego eukariotycznego mRNA. W takich projektach stosuje się odpowiednio dobraną deplecję rRNA.
Niedoszacowanie wymaganej ilości danych
Total RNA-seq obejmuje bardziej zróżnicowaną pulę transkryptów, dlatego wymaga zwykle większej głębokości sekwencjonowania niż mRNA-seq Poly(A).
Niedopasowanie zestawu do deplecji rRNA
Skuteczność deplecji zależy od badanego organizmu. Przed rozpoczęciem projektu należy potwierdzić, czy zestaw jest odpowiedni dla danego gatunku, szczególnie w przypadku organizmów niemodelowych i próbek wielogatunkowych.
Łączenie różnych metod w jednym porównaniu
Próbek przygotowanych metodą Poly(A) i deplecji rRNA nie należy bezpośrednio porównywać w ramach jednej analizy ekspresji bez uwzględnienia silnego efektu technologicznego.
Pytania do briefu projektu
Przed przygotowaniem wyceny i zaplanowaniem eksperymentu zbierz informacje:
Zaplanuj projekt
Opisz projekt - dobierzemy metodę i ilość danych.
Wybrane realizacje i publikacje naszych klientów
Sprawdź, dla jakich instytucji wykonujemy sekwencjonowanie NGS i w jakich publikacjach wykorzystano dostarczone przez nas dane.