Do standardowego eksperymentu RNA-seq należy zaplanować minimum 3, a najlepiej 4-6 niezależnych powtórzeń biologicznych na każdą grupę. W przypadku próbek klinicznych, dużej zmienności biologicznej lub niewielkich oczekiwanych różnic warto zwiększyć liczebność do 8 do 12 próbek na grupę.
Większa liczba powtórzeń biologicznych zwykle poprawia wiarygodność analizy różnicowej ekspresji genów (wykrywania DEG) bardziej niż bardzo głębokie sekwencjonowanie kilku próbek.
Ile powtórzeń wybrać?
| Rodzaj projektu | Liczba powtórzeń na grupę | Rekomendacja |
|---|---|---|
| Eksperyment pilotażowy | 3-4 | Pozwala oszacować zmienność i wielkość efektu |
| Standardowy RNA-seq | 4-6 | Najlepszy wybór dla większości projektów |
| Linie komórkowe lub materiał o małej zmienności | 3-5 | Minimum 3 niezależne hodowle |
| Rośliny laboratoryjne i linie wsobne | 4-6 | Każde powtórzenie powinno być prowadzone niezależnie |
| Tkanki zwierzęce | 5-8 | Należy uwzględnić wiek, płeć i pochodzenie materiału |
| Próbki ludzkie lub kliniczne | 8-12 lub więcej | Zwykle duża zmienność międzyosobnicza |
| Subtelne różnice ekspresji | 8-12 lub więcej | Wskazana analiza mocy statystycznej |
| Szereg czasowy | 3-6 na punkt i grupę | Każdy punkt czasowy wymaga własnych powtórzeń |
Powtórzenie biologiczne vs. techniczne
Powtórzenia biologiczne to niezależne organizmy, pacjenci, hodowle lub eksperymenty należące do tej samej grupy.
Powtórzenia techniczne powstają przez ponowną izolację, przygotowanie kilku bibliotek albo powtórne sekwencjonowanie tego samego materiału. Nie zastępują powtórzeń biologicznych i zazwyczaj są łączone w analizie jako jedna próbka.
Kiedy wystarczą 3 powtórzenia?
Trzy powtórzenia można zastosować, gdy:
- projekt ma charakter pilotażowy,
- materiał jest jednorodny,
- warunki eksperymentu są dobrze kontrolowane,
- spodziewane różnice ekspresji są duże,
- budżet nie pozwala na zwiększenie liczby próbek.
Jest to jednak wartość minimalna. Utrata lub odrzucenie jednej próbki pozostawia tylko dwa powtórzenia, co znacząco ogranicza analizę statystyczną.
Kiedy wybrać 4 do 6 powtórzeń?
To rekomendowany wariant dla większości standardowych eksperymentów RNA-seq, szczególnie gdy:
- celem jest analiza różnicowej ekspresji genów,
- spodziewane efekty są umiarkowane,
- wyniki mają być podstawą publikacji,
- materiał wykazuje naturalną zmienność,
- planowana jest analiza GO, KEGG lub GSEA.
Kiedy potrzeba 8-12 próbek lub więcej?
Większą liczbę powtórzeń warto zaplanować, gdy:
- badane są próbki kliniczne lub pochodzące od różnych osobników,
- oczekiwane zmiany ekspresji są niewielkie,
- materiał jest silnie zróżnicowany,
- analiza obejmuje wiele czynników,
- poszukiwane są biomarkery,
- dostępne są dane pilotażowe umożliwiające analizę mocy.
Jak obliczyć całkowitą liczbę próbek?
Liczbę grup, czyli kombinacji genotypów, warunków i punktów czasowych, należy pomnożyć przez liczbę powtórzeń.
Przykład:
2 genotypy × 2 warunki × 4 powtórzenia = 16 próbek
Każda kombinacja warunków powinna mieć własne niezależne powtórzenia biologiczne.
Czy można łączyć próbki w pule?
Tak, jeśli pojedynczy organizm lub tkanka nie dostarcza wystarczającej ilości RNA. Należy jednak pamiętać, że:
- jedna pula jest jednym powtórzeniem biologicznym,
- osobniki połączone w jednej puli nie są osobnymi replikami,
- każda pula powinna być przygotowana niezależnie,
- wszystkie pule powinny zawierać porównywalną ilość materiału.
Trzy niezależne pule po pięć roślin oznaczają 3 powtórzenia biologiczne, a nie 15.
Wymagania dotyczące próbek
Wszystkie próbki powinny:
- pochodzić z jednoznacznie określonych grup,
- być pobrane na porównywalnym etapie,
- być przygotowane i przechowywane w taki sam sposób,
- mieć porównywalną jakość RNA,
- posiadać pełne metadane,
- mieć jednoznaczne oznaczenia.
Dla standardowego mRNA-seq rekomendowane jest:
- powyżej 0,5 µg total RNA,
- stężenie powyżej 50 ng/µl,
- objętość powyżej 20 µl,
- OD260/280: 1,8-2,2,
- RIN powyżej 7, a dla roślin powyżej 6.
Próbki low-input, po FACS lub materiał zdegradowany wymagają indywidualnej kwalifikacji.
Orientacyjna ilość danych
Dla standardowej analizy ekspresji rekomendowane jest zwykle:
- 20-30 mln par odczytów na próbkę,
- około 6-10 Gb danych na próbkę przy 2 × 150 bp.
Przy ograniczonym budżecie lepiej zwiększyć liczbę powtórzeń biologicznych niż bardzo głęboko sekwencjonować tylko kilka próbek.
Typowe błędy
- zastosowanie tylko dwóch próbek na grupę,
- traktowanie powtórzeń technicznych jako biologicznych,
- łączenie wszystkich osobników w jedną pulę,
- zastępowanie replik głębszym sekwencjonowaniem,
- brak dodatkowego materiału na wypadek odrzucenia próbki,
- przygotowanie kontroli i próbek badanych w różnych partiach,
- nieuwzględnienie płci, wieku, genotypu lub innych źródeł zmienności,
- uznanie komórek z jednego dawcy w scRNA-seq za niezależne powtórzenia.
Zaplanuj projekt
Nie masz pewności i potrzebujesz konsultacji? Opisz projekt - dobierzemy liczbę próbek, metodę i ilość danych.
Na podstawie układu eksperymentu i rodzaju materiału pomożemy ustalić liczbę powtórzeń biologicznych, sposób przygotowania bibliotek oraz odpowiednią głębokość sekwencjonowania.
Wybrane realizacje i publikacje naszych klientów
Sprawdź, dla jakich instytucji wykonujemy sekwencjonowanie NGS i w jakich publikacjach wykorzystano dostarczone przez nas dane.