Správné ošetření buněk po jejich odběru nebo třídění FACS má zásadní význam pro kvalitu následných analýz RNA. RNA je molekula obzvláště náchylná k degradaci, a proto může způsob uchovávání a přepravy materiálu přímo ovlivnit kvalitu získaných dat.
Přeprava buněk v pufru
Buňky určené k izolaci RNA lze přepravovat ve standardních pufrech používaných při třídění FACS, optimalizovaných pro zachování jejich životaschopnosti a stability. Není nutné používat jediný přesně stanovený pufr.
Nejdůležitější je, aby použitý pufr:
- neobsahoval neobvykle vysokou koncentraci solí,
- byl pokud možno prostý RNáz,
- neobsahoval složky, které mohou vést k degradaci RNA,
- udržoval buněčný materiál v dobrém stavu a zajišťoval jeho stabilitu během přepravy.
Ve většině případů provádíme v počáteční fázi izolace RNA výměnu pufru. Jeho přesné složení by tedy nemělo představovat problém, pokud splňuje výše uvedené požadavky.
Ochrana vzorků v Zymo DNA/RNA Shield
Alternativním řešením je použití Zymo DNA/RNA Shield. Ošetření tímto činidlem je plně akceptovaným způsobem ochrany materiálu určeného pro analýzy RNA.
DNA/RNA Shield stabilizuje biologický materiál a chrání nukleové kyseliny před degradací. Může být zvláště užitečný, pokud se izolace RNA neprovádí bezprostředně po odběru buněk nebo pokud je nutné vzorky přepravovat. Jeho použití může být výhodné také z hlediska organizace práce a nákladů na ošetření jednotlivého vzorku.
Informaci o použití DNA/RNA Shield nebo jiného pufru je vždy nutné výslovně uvést ve formuláři s údaji o vzorku (SIF). To umožňuje vhodně přizpůsobit postup izolace RNA.
Zvláštní význam pro low-input mRNA-seq
Správná ochrana materiálu je obzvláště důležitá při low-input mRNA-seq, tedy analýze prováděné z velmi malého počtu buněk nebo malého množství RNA. I částečná degradace RNA pak může významně ovlivnit možnost přípravy knihovny, reprezentativnost transkriptů a kvalitu získaných dat.
U vzorků low-input doporučujeme předem konzultovat počet buněk, typ pufru, objem vzorku, dobu přepravy a plánované podmínky uchovávání.
Hlavním cílem zůstává zachování vysoké kvality buněčného materiálu a účinná ochrana RNA před degradací od odběru vzorku až do zahájení izolace.