Prawidłowe zabezpieczenie komórek po ich pobraniu lub sortowaniu FACS ma kluczowe znaczenie dla jakości późniejszych analiz RNA. RNA jest cząsteczką szczególnie podatną na degradację, dlatego sposób przechowywania i transportu materiału może bezpośrednio wpłynąć na jakość uzyskanych danych.
Transport komórek w buforze
Komórki przeznaczone do izolacji RNA mogą być transportowane w standardowych buforach stosowanych podczas sortowania FACS, zoptymalizowanych pod kątem zachowania ich żywotności i stabilności. Nie ma konieczności stosowania jednego, ściśle określonego buforu.
Najważniejsze jest, aby zastosowany bufor:
- nie zawierał nietypowo wysokiego stężenia soli,
- był możliwie wolny od RNaz,
- nie zawierał składników mogących prowadzić do degradacji RNA,
- zapewniał dobrą kondycję i stabilność materiału komórkowego podczas transportu.
W większości przypadków na początkowym etapie izolacji RNA wykonujemy wymianę buforu. Jego dokładny skład nie powinien zatem stanowić problemu, jeżeli spełnia powyższe wymagania.
Zabezpieczenie próbek w Zymo DNA/RNA Shield
Alternatywnym rozwiązaniem jest zastosowanie Zymo DNA/RNA Shield. Odczynnik ten jest w pełni akceptowanym sposobem zabezpieczania materiału przeznaczonego do analiz RNA.
DNA/RNA Shield stabilizuje materiał biologiczny i chroni kwasy nukleinowe przed degradacją. Może być szczególnie przydatny, gdy izolacja RNA nie jest wykonywana bezpośrednio po pobraniu komórek lub gdy próbki wymagają transportu. Jego zastosowanie może być również korzystne pod względem organizacyjnym i kosztu zabezpieczenia pojedynczej próbki.
Informację o zastosowaniu DNA/RNA Shield lub innego buforu należy zawsze wyraźnie zaznaczyć w formularzu informacji o próbkach (SIF). Pozwala to odpowiednio dostosować procedurę izolacji RNA.
Szczególne znaczenie w low-input mRNA-seq
Odpowiednie zabezpieczenie materiału jest szczególnie istotne w przypadku low-input mRNA-seq, czyli analizy wykonywanej z bardzo małej liczby komórek lub niewielkiej ilości RNA. Nawet częściowa degradacja RNA może wówczas istotnie wpłynąć na możliwość przygotowania biblioteki, reprezentatywność transkryptów oraz jakość uzyskanych danych.
W przypadku próbek low-input rekomendowane jest wcześniejsze skonsultowanie liczby komórek, rodzaju buforu, objętości próbki, czasu transportu oraz planowanych warunków przechowywania.
Najważniejszym celem pozostaje zachowanie wysokiej jakości materiału komórkowego oraz skuteczna ochrona RNA przed degradacją od momentu pobrania próbki aż do rozpoczęcia izolacji.