Celogenomové sekvenování (WGS)

Celogenomové sekvenování je pokročilá metoda sekvenování, která umožňuje určit úplnou sekvenci genomu organismu. Tato technika umožňuje analyzovat veškerou DNA bez ohledu na to, zda pochází z bakterií, rostlin, zvířat nebo lidí.

Průběh procesu WGS

Využití WGS

Varianty služby WGS

• Celogenomové sekvenování člověka
• Resekvenování WGS (rostliny/zvířata) s referenčním genomem
• De novo WGS - bez referenčního genomu
• Sestavení genomu na základě Hi-C

Technické parametry WGS

• Režim sekvenování:
  • Illumina: 2 × 150 bp
  • ONT: 8 kb nebo 100 kb pro sekvenování de novo WGS
  • PacBio Revio: 15 kb-HiFi
• Doporučená hloubka pokrytí genomu / množství dat na vzorek:
  • Celogenomové sekvenování člověka a resekvenování WGS
    • Illumina: ≥ 30 X
    • Nanopore PromethION 48: ≥ 30 X
    • PacBio Revio: ≥ 10 X
  • De novo WGS - doporučený přístup využívající více platforem zahrnuje:
    • Genome survey (orientační analýza genomu): Illumina NovaSeq: ≥ 50 X
    • Sekvenování genomu: PacBio Revio: ≥ 30 X
    • Doplnění mezer: Nanopore PromethION 48 (délka čtení 100 kb): ≥ 40 X
    • Hi-C: Illumina NovaSeq: ≥ 100 X
  • Sestavení genomu na základě Hi-C
    • Hi-C: Illumina NovaSeq: ≥ 100 X

Požadavky na vzorky

Minimální požadavky na vzorky (Illumina):

• Typ vzorku: gDNA
• Množství: > 50 ng
• Koncentrace (NanoDrop): >10 ng/μL
• Objem: >20 μL
• Čistota (OD260/280): 1,7 - 2,2

Minimální požadavky na vzorky (PacBio):

• Typ vzorku: gDNA
• Množství: > 10 μg
• Koncentrace (NanoDrop): >50 ng/μL
• Objem: >20 μL
• Čistota (OD260/280): 1,7 - 2,2

Minimální požadavky na vzorky (ONT):

• Typ vzorku: gDNA
• Množství: > 4 μg
• Koncentrace (NanoDrop): >50 ng/μL
• Objem: >20 μL
• Čistota (OD260/280): 1,7 - 2,2

Doporučujeme zaslat vzorek ve větším množství / vyšší koncentraci, než je požadované minimum.

Doporučujeme, aby všechny vzorky určené pro službu de novo WGS pocházely od stejného jedince. Pro anotaci genomu je nutné sekvenování transkriptomu (Illumina). Doporučujeme odebrat směsné vzorky z různých tkání a časových období.

Z dodaných vzorků je možná také izolace DNA. Podrobnosti zde.

Bioinformatická analýza WGS

• Celogenomové sekvenování člověka
  • Kontrola kvality dat po sekvenování
  • Mapování na referenční genom
  • Identifikace a anotace SNP
  • Identifikace a anotace malých indelů
  • Identifikace a anotace SV, CNV (pouze při sekvenování dlouhých čtení nebo při vysoké hloubce pokrytí)
  • Rozložení variant v genomu
  • Funkční anotace variant (NR, SwissProt, GO, KEGG, COG, KOG, Pfam)
• Resekvenování WGS
  • Kontrola kvality dat po sekvenování
  • Mapování na referenční genom
  • Identifikace a anotace SNP
  • Identifikace a anotace malých indelů
  • Identifikace a anotace SV, CNV
  • Rozložení variant v genomu
  • Nesynonymní mutace
  • Funkční anotace mutovaných genů
• de novo WGS
  • Genome survey (orientační analýza genomu):
    • Odhad velikosti genomu
    • Odhad heterozygotnosti genomu, podílu repetitivních sekvencí a obsahu GC v genomu
  • Sestavování genomu de novo:
    • Zpracování a vyhodnocení surových dat
    • Sestavení genomu
  • Anotace genomu
    • Celogenomová anotace:
      • Kódující geny, repetitivní sekvence, transpozonové elementy, nekódující RNA, pseudogeny
    • Funkční anotace:
      • NR, eggNOG, GO, KEGG, TrEMBL, Swiss-Prot, Pfam, InterPro
  • Sestavení na základě Hi-C
    • Zpracování a vyhodnocení dat a hodnocení knihovny Hi-C
    • Propojování kontigů pomocí Hi-C
    • Hodnocení kvality sestavení

Ukázkové obrázky