RNA-seq

Sekvenování mRNA, tedy sekvenování RNA zaměřené na mediátorovou RNA, je technika založená na sekvenování nové generace (NGS), která umožňuje zkoumat transkriptom - soubor mRNA přítomné v dané buňce nebo tkáni v určitém okamžiku. Tato metoda poskytuje celkový obraz genové exprese, včetně kvantitativních a kvalitativních informací o mRNA.

Průběh procesu RNA-seq

Využití RNA-seq

Technická specifikace mRNA-seq (poly(A))

• Způsob přípravy knihoven: izolace mRNA s poly(A) konci z celkové RNA pomocí magnetických kuliček potažených oligo(dT), které vážou poly(A) na koncích mRNA. Celková RNA se smíchá s kuličkami a po navázání poly(A)-mRNA se ostatní typy RNA (rRNA, tRNA) odstraní promýváním.
• Možnosti přípravy knihoven:
  • Stranded - příprava knihovny se zachováním informace o orientaci vlákna. Při přípravě vzorku se zachovává informace o směru transkripce RNA, což umožňuje určit, ze kterého vlákna DNA daný transkript pochází.
  • Non-stranded - příprava knihovny bez zachování informace o orientaci vlákna. V tomto případě se informace o směru transkripce RNA nezachovává, což vede ke ztrátě údajů o orientaci vlákna.
• Režim sekvenování: 2 × 150 bp
• Sekvenátory: platforma Illumina, sekvenátory NovaSeq 6000 a NovaSeq X.
• Doporučené množství dat na vzorek:
  • 6 Gb na vzorek
  • 10 Gb na vzorek
  • 15 Gb na vzorek
  • K dispozici jsou i další konfigurace podle potřeb zákazníka.
• Kvalita dat: Q30 ≥ 85 %
• Doporučené požadavky na vzorky:
  • Typ vzorku: celková RNA
  • Množství: > 0,5 μg
  • Koncentrace (NanoDrop): >50 ng/μL
  • Objem: >20 μL
  • Čistota (OD260/280): 1,8 - 2,2
  • RIN: >7 (u rostlin > 6)
• MINIMÁLNÍ požadavky na vzorky:
  • Typ vzorku: celková RNA
  • Množství: > 0,2 μg
  • Koncentrace (Qubit): >20 ng/μL
  • Objem: >20 μL
  • Čistota (OD260/280): 1,7 - 2,5
  • RIN: >4,5 (u rostlin > 4)
  • 5,0 ≥ 28S/18S ≥ 1,0
• Je možná také izolace RNA z dodaných vzorků. Podrobnosti zde.

Bioinformatická analýza mRNA-seq (poly(A))

Pokročilá bioinformatická analýza v balíčku mRNA-seq zahrnuje mimo jiné:

• Kontrola kvality dat
• Mapování na referenční genom
• Kontrola kvality knihoven
• Analýza SNP/indel
• Optimalizace struktury genů
• Analýza nových genů
• Kvantifikace genové exprese
• Analýza diferenciální exprese (DEG)
• Funkční anotace DEGs a analýza obohacení
• Analýza diferenciálního alternativního sestřihu
• Analýza obohacení genových sad (GSEA)
• Diferenciální využití exonů (DEU)

Ukázkové grafy ze zprávy o bioinformatické analýze

Technická specifikace RNA-seq (deplece rRNA)

• Způsob přípravy knihoven: odstranění ribozomální RNA ze vzorku, v němž může tvořit až 90 % RNA, umožňuje zachovat pro analýzu frakce mRNA, lncRNA, circRNA a malých RNA.
• Režim sekvenování: 2 × 150 bp
• Sekvenátory: platforma Illumina, sekvenátory NovaSeq 6000 a NovaSeq X.
• Doporučený objem dat na vzorek:
  • 12 Gb na vzorek
  • 16 Gb na vzorek (jedná se o minimální objem umožňující také analýzu circRNA)
  • K dispozici jsou i další konfigurace podle potřeb zákazníka.
• Kvalita dat: Q30 ≥ 85 %
• Doporučené požadavky na vzorky:
  • Typ vzorku: celková RNA
  • Množství: > 2000 ng
  • Koncentrace (NanoDrop): >100 ng/μL
  • Objem: >10 μL
  • Čistota (OD260/280): 1,8 - 2,2
  • RIN: >7 (u rostlin > 6)
• MINIMÁLNÍ požadavky na vzorky:
  • Typ vzorku: celková RNA
  • Množství: > 500 ng
  • Koncentrace (Qubit): >80 ng/μL
  • Objem: >10 μL
  • Čistota (OD260/280): 1,7 - 2,5
  • RIN: >6,5 (u rostlin > 6)
  • 5,0 ≥ 28S/18S ≥ 1,0
• Z dodaných vzorků je možná také izolace DNA. Podrobnosti zde.

Bioinformatická analýza RNA-seq (deplece rRNA)

Pokročilá bioinformatická analýza v balíčku RNA-seq zahrnuje:

• Analýzu typů transkriptů za účelem identifikace mRNA a lncRNA.
• Studium vzájemných vazeb a závislostí mezi lncRNA a mRNA.
• Posouzení uspořádání genů včetně hranic intronů a exonů, alternativního sestřihu a nově objevených genů.
• Měření úrovně exprese lncRNA a mRNA ve vzorcích.
• Identifikaci genů (DEG) a lncRNA (DE-lncRNA) s diferenciální expresí mezi vzorky nebo skupinami.
• Přiřazení funkcí diferenciálně exprimovaným genům (DEG) a diferenciálně exprimovaným lncRNA (DE-lncRNA) a také identifikace biologických drah a procesů, do nichž se zapojují.
• Identifikaci cílových genů regulovaných lncRNA a analýzu jejich potenciálních funkcí.
• Studium potenciálních proteinových interakcí souvisejících s diferenciálně exprimovanými lncRNA.
• Posouzení konzervovanosti sekvencí lncRNA napříč druhy, které umožňuje určit jejich potenciální biologický význam.
• Přehled a klasifikace dříve identifikovaných lncRNA.
• Identifikaci potenciálních prekurzorů miRNA na základě sekvencí lncRNA.
• Identifikaci cílových genů regulovaných miRNA a studium jejich funkcí v biologických procesech.