Dva parametry, které volíte
Kolik dat tedy zvolit? V závislosti na cíli výzkumu jsou klíčové tyto parametry:
01
Objem dat
v gigabajtech nebo počtu čtení
02
Pokrytí (coverage)
tedy průměrný počet přečtení/sekvenování každého nukleotidu v genomu
Objem dat
Co znamená objem dat při sekvenování a kdy se používá?
Při sekvenování se objem dat obvykle vyjadřuje dvěma způsoby:
01
Počet čtení (např. 30 mil. čtení, tedy 30 milionů čtení)
Čtení (angl. reads) jsou fragmenty DNA získané sekvenátorem. V závislosti na technologii může jít např. o čtení 1×50 bp, 2×150 bp apod., což znamená čtení jednoho konce fragmentu o délce 50 nukleotidů nebo čtení obou konců fragmentu (paired end) o délce 150 nukleotidů každé.
02
Objem dat v Gb/GB (např. 10 GB)
Jde o celkový počet sekvenovaných bází (nukleotidů) - čím delší jsou čtení a čím více jich je, tím větší je objem dat.
PŘÍKLAD · 30 MIL. ČTENÍ PAIRED-END 2×150 BP
Počet čtení × 2 × délka čtení
DOSAZENÍ
30 000 000 × 2 × 150 = 9 000 000 000 nukleotidů
VÝSLEDEK
~9 GB surových dat
Výsledný objem dat v GB po vyčištění závisí také na kvalitě dat a filtraci čtení.
Jednotky a vyčištěná data
JEDNOTKY
Gb
gigabáze, tedy miliarda nukleotidů
GB
gigabajt, jednotka počítačové paměti
Gb ≈ GB
v sekvenační praxi 1 Gb ≈ 1 GB v souborech se surovými daty (FASTQ)
Surová vs. vyčištěná data
Surová data zahrnují všechna čtení přímo ze sekvenátoru. Vyčištěná data zahrnují čtení po:
01
Odstranění adaptérů
02
Odfiltrování nekvalitních čtení
Q-score < 20-30
03
Odstranění příliš krátkých fragmentů
Typická ztráta: 5-15 % dat při kontrole kvality.
Příklad: z 9 Gb surových dat (tzv. raw reads) zůstane po filtraci ~8-8,5 Gb vyčištěných dat (tzv. clean read) pro analýzu.
Doporučení pro jednotlivé typy projektů
Způsob vyjádření i doporučený objem dat závisí na typu projektu. U projektů bez jediné referenční sekvence se nepoužívá klasická hloubka pokrytí, ale počet čtení.
TYP PROJEKTU
VELIČINA
DOPORUČENÍ
počet čtení na vzorek
~30 mil. čtení pro analýzu genové exprese (DEGs)
~50-100 mil. pro geny s nízkou expresí, dlouhé nekódující RNA nebo druhy s velmi vysokým počtem genů
~10 mil. čtení pro
RNA-seq bakterií
počet čteníbez jediné referenční sekvence nelze použít klasické „coverage“
5-20 mil. čtení pro vzorky s nízkou komplexitou
≥ 30 mil. čtení nebo více pro environmentální vzorky
počet čteníbez jediné referenční sekvence nelze použít klasické „coverage“
50 000 čtení/tagů na vzorek pro základní identifikaci
> 100 000 čtení pro velmi přesnou taxonomii
hloubka pokrytí (coverage)
standardní hloubka pokrytí je 30×
hloubka pokrytí (coverage)
obvykle 100-150×
Pokrytí (coverage)
Coverage (hloubka pokrytí) je průměrný počet přečtení/sekvenování každého nukleotidu v genomu.
PŘÍKLAD · LIDSKÝ GENOM, 90 Gb DAT
Objem dat ÷ velikost genomu
DOSAZENÍ
90 Gb ÷ 3 Gb
VÝSLEDEK
hloubka pokrytí 30×
Každý nukleotid bude v průměru přečten 30krát. Objem sekvenovaných dat lze vypočítat podle vzorce: počet čtení × délka čtení, tedy např. 30M x 2 x 150.
Jak zvolit množství dat
01
Stanovte cíl projektu
Sekvenujete genom, exom, transkriptom, nebo mikrobiom? Každý typ projektu vyžaduje jiný objem dat.
02
Zohledněte kvalitu vzorku
Fragmentace, degradace nebo malé vstupní množství DNA mohou vyžadovat vyšší hloubku pokrytí (až +20-30 % dat navíc).
03
Určete další faktory, které mohou ovlivnit požadovaný objem dat
Čím náročnější je analýza (např. detekce somatických variant s nízkým zastoupením), tím vyšší hloubka pokrytí bude potřeba. Pokud navíc plánujete porovnat výsledky s jiným, již dokončeným projektem, je vhodné zachovat stejnou specifikaci služby, aby bylo možné výsledky snáze porovnávat.
Vliv na cenu projektu
Ano, objem dat výrazně ovlivňuje cenu služby, proč?
01
Více dat = delší doba provozu sekvenátoru
02
Více dat = vyšší spotřeba reagencií
03
Více dat = delší bioinformatická analýza a větší soubory k uložení
Více proto nemusí vždy znamenat lépe, důležité je najít zlatou střední cestu s ohledem na typ projektu, jeho cíl i rozpočet.
Shrnutí
Zlatá pravidla
01
Více nemusí vždy znamenat lépe
02
Zvolte parametry podle konkrétního cíle projektu
03
Zohledněte kvalitu vzorku
04
Počítejte s rezervou na ztráty při kontrole kvality
Volba objemu dat představuje kompromis mezi kvalitou výsledků, cílem výzkumu a rozpočtem.
Začněte vyplněním našeho chytrého formuláře, který vás provede zjištěním vašich potřeb. Pokud si s něčím nebudete jisti, nezapomeňte ve formuláři uvést, že potřebujete pomoc, a odešlete nám ho. Budeme tak mít přehled o vaší situaci a při rozhovoru vám budeme moci pomoci.
