Kolik čtení potřebuji pro RNA-seq? Jak zvolit hloubku sekvenování?

Pro standardní analýzu diferenciální exprese genů v mRNA-seq nejčastěji postačuje přibližně 20-30 mil. párů čtení na vzorek. Větší hloubka může být potřeba při analýze genů s nízkou expresí, nových transkriptů, alternativního sestřihu, směsného materiálu nebo knihoven pro sekvenování celkové RNA.

Neexistuje však jediná správná hodnota platná pro všechny projekty. Hloubku sekvenování je třeba zvolit podle cíle analýzy, typu knihovny, složitosti transkriptomu, kvality materiálu a počtu biologických replikátů.

Porovnání variant hloubky sekvenování RNA-seq

Níže uvedené hodnoty platí pro paired-end knihovny 2 × 150 bp.

Jde o orientační hodnoty. Skutečný počet využitelných čtení závisí na kvalitě sekvenování, účinnosti odstranění rRNA, podílu duplikátů a počtu čtení, která se jednoznačně mapují na genom nebo transkriptom.

Čtení, nebo páry čtení?

V paired-end projektech se každý fragment knihovny čte z obou konců. Sekvenování 20 mil. fragmentů v režimu 2 × 150 bp tedy generuje:

• 20 mil. párů čtení,
• 40 mil. jednotlivých čtení,
• přibližně 6 Gb surových dat.

Označení „40 mil. reads“ proto může znamenat 40 mil. jednotlivých čtení nebo 40 mil. párů. V popisu projektu pro cenovou nabídku je vždy nutné uvést, zda se hodnota vztahuje k jednotlivým čtením, párům čtení, nebo celkovému počtu bází.

Kdy zvolit 6 Gb - přibližně 20 mil. párů čtení?

Varianta 6 Gb je vhodná, pokud:

• provádíte standardní mRNA-seq se selekcí poly(A),
• hlavním cílem je analýza diferenciální exprese genů,
• zkoumaný organismus má kvalitní genom a anotaci,
• vzorky pocházejí z homogenní tkáně nebo buněčné populace,
• RNA je kvalitní,
• neplánujete rozsáhlou analýzu nových izoforem,
• analyzované geny nemají extrémně nízkou expresi.

Tato varianta často postačuje pro standardní experimenty porovnávající genovou expresi mezi různými podmínkami, tkáněmi, genotypy nebo časovými body.

Kdy zvolit 10 Gb - přibližně 33 mil. párů čtení?

Variantu 10 Gb stojí za to zvážit, pokud:

• požadujete vyšší citlivost detekce málo exprimovaných genů,
• analyzujete složitější transkriptom,
• materiál zahrnuje několik typů buněk,
• plánujete analýzu alternativního sestřihu,
• očekáváte středně velké rozdíly v expresi,
• genom nebo jeho anotace nejsou kompletní,
• chcete mít větší rezervu pro vyřazení čtení při kontrole kvality.

Tato varianta představuje rozumný kompromis mezi náklady a rozsahem získaných informací v náročnějších projektech mRNA-seq.

Kdy zvolit 15 Gb - přibližně 50 milionů párů čtení?

Varianta 15 Gb je opodstatněná, pokud:

• plánujete analýzu nových transkriptů a izoforem,
• zajímá vás diferenciální využití exonů,
• analyzujete složitý alternativní sestřih,
• hledáte málo exprimované transkripty,
• vzorky jsou heterogenní,
• transkriptom zkoumaného organismu je rozsáhlý nebo nedostatečně popsaný,
• je důležitá analýza variant na základě dat RNA-seq,
• očekáváte nižší podíl využitelných čtení.

Větší množství dat však nezaručuje detekci všech transkriptů. Limitujícím faktorem může být komplexita knihovny, kvalita RNA nebo velmi nízká exprese.

Kdy zvolit 12-16 Gb pro Total RNA-seq?

Total RNA-seq s deplecí rRNA obvykle vyžaduje větší množství dat než mRNA-seq se selekcí poly(A). Po odstranění rRNA knihovna stále obsahuje různé typy RNA, včetně mRNA, lncRNA, antisense transkriptů, pre-mRNA a dalších nekódujících RNA.

Zvolte přibližně 12 Gb na vzorek, pokud:

• provádíte standardní Total RNA-seq,
• analyzujete mRNA a lncRNA,
• zajímají vás transkripty bez poly(A) ocasu,
• očekáváte vysokou účinnost deplece rRNA.

Zvolte přibližně 16 Gb nebo více, pokud:

• projekt zahrnuje analýzu circRNA,
• hledáte vzácné nekódující transkripty,
• materiál je velmi komplexní,
• očekáváte vysoký podíl zbytkové rRNA,
• vzorek obsahuje RNA několika organismů.

Pro analýzu zralých miRNA a dalších velmi krátkých RNA je třeba použít samostatný protokol pro sekvenování malých RNA.

Kdy větší hloubka problém nevyřeší?

Další čtení pomáhají pouze tehdy, pokud knihovna obsahuje dostatečné množství různých molekul. Pokud má knihovna nízkou komplexitu, další sekvenování bude generovat převážně duplikáty.

To se týká zejména:

• vzorků s nízkým množstvím vstupního materiálu,
• silně degradované RNA,
• knihoven podrobených intenzivní amplifikaci PCR,
• materiálu s velmi malým počtem buněk,
• vzorků s neúčinnou deplecí rRNA,
• knihoven s nesprávným rozdělením délek fragmentů.

V těchto případech jsou kvalita materiálu a způsob přípravy knihovny důležitější než samotné zvýšení počtu čtení.

Replikáty, nebo větší počet čtení?

V analýze diferenciální exprese má počet nezávislých biologických replikátů často větší význam než sekvenování malého počtu vzorků do velmi vysoké hloubky.

Pokud je rozpočet omezený, je obvykle lepší:

• zahrnout alespoň tři nezávislé biologické replikáty v každé skupině,
• zvolit střední, ale dostatečnou hloubku,
• zachovat vyvážený experimentální design,
• vyhnout se tomu, aby biologická skupina odpovídala konkrétní šarži přípravy knihoven nebo sekvenování.

Zvýšení hloubky sekvenování téhož vzorku nenahrazuje biologickou replikaci a neumožňuje odhadnout variabilitu mezi jedinci.

Požadavky na vzorky

Sekvenování mRNA se selekcí poly(A)

Doporučené parametry:

• materiál: celková RNA,
• množství: více než 0,5 µg,
• koncentrace: více než 50 ng/µL,
• objem: více než 20 µL,
• OD260/280: 1,8-2,2,
• RIN: vyšší než 7, u rostlin vyšší než 6.

Minimální parametry:

• množství: více než 0,2 µg,
• koncentrace měřená přístrojem Qubit: více než 20 ng/µL,
• objem: více než 20 µL,
• OD260/280: 1,7-2,5,
• RIN: vyšší než 4,5, u rostlin vyšší než 4.

Sekvenování celkové RNA s deplecí rRNA

Doporučené parametry:

• materiál: celková RNA,
• množství: více než 2 µg,
• koncentrace: více než 100 ng/µL,
• objem: více než 10 µL,
• OD260/280: 1,8-2,2,
• RIN: vyšší než 7, u rostlin vyšší než 6.

U projektů s nízkým množstvím vstupního materiálu, vzorků po FACS, materiálu FFPE nebo RNA nesplňující standardní požadavky je třeba parametry posoudit individuálně. Menší množství RNA může vyžadovat změnu protokolu, ale nemusí vždy znamenat nutnost zvýšit hloubku sekvenování.

Co ovlivňuje potřebný počet čtení?

Typické chyby při plánování hloubky sekvenování

Otázky pro plánování projektu

Než určíte potřebné množství dat, zvažte následující otázky:

Naplánujte si projekt

Popište projekt - vybereme vhodnou metodu a množství dat.

Na základě typu knihovny, zkoumaného organismu, kvality RNA a plánovaného rozsahu analýzy vám pomůžeme určit počet čtení potřebný pro každý vzorek. Navrhneme také způsob přípravy knihovny, režim sekvenování a rozsah bioinformatické analýzy.