Hloubku pokrytí WGS volíme podle cíle výzkumu: 0,5-5× se může osvědčit v populačních projektech s vhodnou statistickou analýzou, 15× může představovat kompromis mezi náklady a přesností a 30× je častým výchozím bodem pro identifikaci variant u jednotlivého jedince. Hloubka pokrytí kolem 100× se zvažuje mimo jiné při výzkumu nádorů, kdy se hledané varianty vyskytují jen v části molekul DNA. Konečná volba závisí také na organismu, ploidii, kvalitě materiálu a požadované citlivosti analýzy.
Následující srovnání se týká především WGS s krátkými čteními a mapováním na referenční genom, např. Illumina PE150. Projekty sestavování genomu de novo, sekvenování s dlouhými čteními a analýza polyploidů vyžadují samostatnou volbu parametrů.
Co znamená pokrytí genomu?
Hloubka pokrytí 30× znamená, že každá pozice genomu je přečtena v průměru 30krát. Neznamená to však, že každý úsek bude zastoupen přesně 30 čteními (některé oblasti budou mít vyšší hloubku pokrytí, jiné nižší nebo zůstanou nepřečtené).
Při hodnocení výsledků je proto vhodné zohlednit také rovnoměrnost pokrytí a podíl genomu dosahující stanovené prahové hodnoty, např. alespoň 10× nebo 20×.
Srovnání: jaká hloubka pokrytí pro který projekt?
| Hloubka pokrytí | Kdy ji zvážit? | Hlavní přínos | Nejdůležitější omezení |
|---|---|---|---|
| 0,5× | Rozsáhlé populační projekty; profilování rozsáhlých změn počtu kopií ve vhodně navržené studii | Nízké náklady na sekvenování jednoho vzorku | Pro mnoho pozic chybí přímé čtení; samo o sobě neumožňuje přesnou genotypizaci celého genomu |
| 5× | Analýza diverzity a struktury populace; genotypizace s využitím modelů zohledňujících nejistotu genotypu | Možnost vyšetřit větší počet jedinců | Omezená spolehlivost určení genotypů, zejména heterozygotních |
| 15× | Projekty resekvenování, v nichž je přijatelná nižší citlivost než při 30× | Kompromis mezi množstvím dat a náklady | Vyšší riziko přehlédnutí variant v oblastech s nižší hloubkou pokrytí |
| 30× | Identifikace SNP a malých indelů u jednotlivých diploidních jedinců | Vyšší spolehlivost genotypizace a menší závislost na imputaci | Nezaručuje detekci všech variant ani úplné přečtení repetitivních oblastí |
| 100× | Vybrané onkologické projekty a analýzy variant s nízkou frekvencí alely | Více čtení, která mohou potvrdit variantu | Vyšší náklady; nadále omezená citlivost při velmi nízkém podílu varianty |
Jde o orientační vodítko pro výběr, nikoli o univerzální prahové hodnoty kvality. Při nízké hloubce pokrytí je zásadní metoda analýzy; při vyšší pak kvalita mapování a povaha hledaných změn.
Kdy zvolit nižší a kdy vyšší hloubku pokrytí?
0,5× nebo 5×: když je nejdůležitější velký počet vzorků
0,5× je vhodné zvážit, pokud plánujete rozsáhlou kohortu a máte k dispozici vhodný referenční panel pro statistické doplnění chybějících nebo nejistých genotypů. Účinnost tohoto přístupu závisí na tom, nakolik panel odpovídá zkoumané populaci, a na frekvenci analyzovaných variant.
5× je vhodné zvážit, pokud potřebujete více přímých pozorování sekvence, ale prioritou zůstává počet jedinců ve zkoumané populaci. Analýza by měla zohledňovat nejistotu genotypů (samotné zvýšení hloubky pokrytí z 0,5× na 5× neodstraní všechna omezení WGS s nízkou hloubkou pokrytí).
Absence referenčního panelu nemusí vždy vylučovat statistické doplnění chybějících nebo nejistých genotypů, vyžaduje však dostatečně velký soubor vzorků, vhodné metody a validaci. Výsledky získané u člověka nelze automaticky přenášet na nemodelové druhy.
15× nebo 30×: když záleží na genotypu konkrétního jedince
15× lze zvolit, pokud projekt připouští určitou část chybějících nebo méně spolehlivě určených genotypů a ušetřené prostředky umožní zvýšit počet biologických vzorků.
30× je nejčastěji voleným výchozím bodem, pokud je prioritou spolehlivé rozlišení homozygotů a heterozygotů a identifikace variant bez výrazného spoléhání na statistické doplnění chybějících nebo nejistých genotypů. U lidského WGS se obvykle doporučuje přibližně 30-50× v závislosti na použití a modelu analýzy.
30× nebo 100×: když se varianta vyskytuje jen v části DNA
V nádorovém vzorku závisí podíl varianty mimo jiné na zastoupení nádorových buněk, subklonalitě a změnách počtu kopií. Projekt proto často vyžaduje vyšší hloubku pokrytí a odpovídající vzorek nenádorové tkáně.
100× nezaručuje detekci variant s podílem 1 %. Při lokální hloubce pokrytí 100× připadá na takovou variantu v průměru pouze jedno čtení s alternativní alelou. Jde o ilustrační výpočet, nikoli o mez detekce; při velmi nízkém podílu varianty je vhodné zvážit cílené sekvenování s vysokou hloubkou pokrytí.
Požadavky na vzorek
Pro standardní WGS Illumina platí tyto požadavky:
| Parametr | Požadavek |
|---|---|
| Materiál | Genomová DNA - gDNA |
| Celkové množství DNA | >50 ng |
| Koncentrace | >10 ng/µL |
| Objem | >20 µL |
| Čistota A260/A280 | 1,7- 2,2 |
Požadavky na množství, koncentraci a objem musí být splněny současně. Doporučujeme zaslat materiál navíc pro kontrolu kvality a přípravu knihovny. Podrobnosti najdete v popisu služby WGS.
Nižší hloubka pokrytí automaticky neznamená menší požadované množství DNA: vstupní materiál závisí především na způsobu přípravy knihovny. U degradované DNA, FFPE, cfDNA nebo malého množství materiálu je nutné podmínky dohodnout individuálně. Dostupné protokoly se liší požadavky na vstupní materiál.
Kolik dat je potřeba?
Základní přepočet je jednoduchý:
Množství dat [Gb] = velikost referenčního genomu [Gb] × plánovaná hloubka pokrytí
U diploidního organismu se hloubka pokrytí standardně vztahuje k délce haploidního genomu, kterou již znovu nenásobíme dvěma.
Níže jsou uvedeny příklady výpočtů pro genom o velikosti 3,0 Gb a čtení PE150, tedy 2 × 150 bp:
| Hloubka pokrytí | Teoretické množství dat | Počet párů čtení PE150 |
|---|---|---|
| 0,5× | 1,5 Gb | 5 mil. |
| 5× | 15 Gb | 50 mil. |
| 15× | 45 Gb | 150 mil. |
| 30× | 90 Gb | 300 mil. |
| 100× | 300 Gb | 1 mld. |
Vlastní výpočty; hodnoty před zohledněním ztrát dat.
Jeden pár PE150 poskytuje nominálně 300 bází. Gb označuje miliardu bází a GB gigabajt paměti; tyto jednotky nejsou zaměnitelné.
V praxi je třeba zohlednit čtení vyřazená při kontrole kvality, nenamapovaná čtení a duplikáty. Například při předpokladu 80 % využitelných dat vyžaduje získání 90 Gb skutečně využitých bází přibližně 112,5 Gb surových dat. Jde o modelový výpočet, skutečná rezerva závisí na vzorku a knihovně.
Před objednáním je třeba upřesnit, zda nabídka uvádí množství surových dat, dat po vyčištění, nebo cílovou hloubku pokrytí po mapování a filtraci.
Časté chyby při volbě hloubky pokrytí
Jaké informace uvést v zadání?
Pro výběr vhodné metody a objemu dat uveďte:
Popište projekt a my vám pomůžeme vybrat metodu a objem dat
Zašlete informace o organismu, vzorcích a cíli studie. Pomůžeme vám zvolit technologii, hloubku pokrytí a rozsah bioinformatické analýzy podle otázky, na kterou má váš projekt odpovědět.
Vybrané realizované projekty a publikace našich zákazníků
Podívejte se, pro které instituce provádíme sekvenování NGS a v jakých publikacích byla využita námi dodaná data.