Pro standardní experiment RNA-seq je třeba naplánovat minimálně 3, ideálně však 4-6 nezávislých biologických replikátů pro každou skupinu. U klinických vzorků, při vysoké biologické variabilitě nebo malých očekávaných rozdílech je vhodné zvýšit počet na 8 až 12 vzorků na skupinu.
Vyšší počet biologických replikátů obvykle zvyšuje spolehlivost analýzy diferenciální exprese genů (detekce DEG) více než velmi hluboké sekvenování několika vzorků.
Kolik replikátů zvolit?
| Typ projektu | Počet replikátů na skupinu | Doporučení |
|---|---|---|
| Pilotní experiment | 3-4 | Umožňuje odhadnout variabilitu a velikost účinku |
| Standardní RNA-seq | 4-6 | Nejlepší volba pro většinu projektů |
| Buněčné linie nebo materiál s nízkou variabilitou | 3-5 | Minimálně 3 nezávislé kultury |
| Laboratorní rostliny a inbrední linie | 4-6 | Každý replikát by měl být prováděn nezávisle |
| Živočišné tkáně | 5-8 | Je třeba zohlednit věk, pohlaví a původ materiálu |
| Lidské nebo klinické vzorky | 8-12 nebo více | Obvykle vysoká interindividuální variabilita |
| Malé rozdíly v expresi | 8-12 nebo více | Doporučuje se analýza statistické síly |
| Časová řada | 3-6 na časový bod a skupinu | Každý časový bod vyžaduje vlastní replikáty |
Biologický vs. technický replikát
Biologické replikáty jsou nezávislé organismy, pacienti, kultury nebo experimenty patřící do stejné skupiny.
Technické replikáty vznikají opakovanou izolací, přípravou několika knihoven nebo opakovaným sekvenováním téhož materiálu. Nenahrazují biologické replikáty a při analýze se obvykle slučují do jednoho vzorku.
Kdy stačí 3 replikáty?
Tři replikáty lze použít, pokud:
- projekt má pilotní charakter,
- materiál je homogenní,
- podmínky experimentu jsou dobře kontrolované,
- očekávané rozdíly v expresi jsou velké,
- rozpočet neumožňuje zvýšit počet vzorků.
Jde však o minimální počet. Po ztrátě nebo vyřazení jednoho vzorku zbývají pouze dva replikáty, což výrazně omezuje statistickou analýzu.
Kdy zvolit 4 až 6 replikátů?
Tato varianta se doporučuje pro většinu standardních experimentů RNA-seq, zejména pokud:
- cílem je analýza diferenciální exprese genů,
- očekávané účinky jsou středně výrazné,
- výsledky mají sloužit jako podklad pro publikaci,
- materiál vykazuje přirozenou variabilitu,
- plánujete analýzu GO, KEGG nebo GSEA.
Kdy je potřeba 8-12 vzorků nebo více?
Vyšší počet replikátů je vhodné naplánovat, pokud:
- zkoumáte klinické vzorky nebo vzorky od různých jedinců,
- očekávané změny exprese jsou malé,
- materiál je značně heterogenní,
- analýza zahrnuje více faktorů,
- hledáte biomarkery,
- máte k dispozici pilotní data umožňující analýzu statistické síly.
Jak vypočítat celkový počet vzorků?
Počet skupin, tedy kombinací genotypů, podmínek a časových bodů, je třeba vynásobit počtem replikátů.
Příklad:
2 genotypy × 2 podmínky × 4 replikáty = 16 vzorků
Každá kombinace podmínek by měla mít vlastní nezávislé biologické replikáty.
Lze vzorky poolovat?
Ano, pokud jeden organismus nebo tkáň neposkytuje dostatečné množství RNA. Je však třeba mít na paměti, že:
- jeden pool představuje jeden biologický replikát,
- jedinci spojení v jednom poolu nejsou samostatnými replikáty,
- každý pool by měl být připraven nezávisle,
- všechny pooly by měly obsahovat srovnatelné množství materiálu.
Tři nezávislé pooly po pěti rostlinách představují 3 biologické replikáty, a nikoli 15.
Požadavky na vzorky
Všechny vzorky by měly:
- pocházet z jednoznačně vymezených skupin,
- být odebrány ve srovnatelné fázi,
- být připraveny a uchovávány stejným způsobem,
- mít srovnatelnou kvalitu RNA,
- mít úplná metadata,
- být jednoznačně označeny.
Pro standardní mRNA-seq se doporučuje:
- více než 0,5 µg celkové RNA,
- koncentrace vyšší než 50 ng/µL,
- objem větší než 20 µL,
- OD260/280: 1,8-2,2,
- RIN vyšší než 7, u rostlin vyšší než 6.
Vzorky low-input, vzorky po FACS nebo degradovaný materiál vyžadují individuální posouzení vhodnosti.
Orientační objem dat
Pro standardní analýzu exprese se obvykle doporučuje:
- 20-30 mil. párů čtení na vzorek,
- přibližně 6-10 Gb dat na vzorek při 2 × 150 bp.
Při omezeném rozpočtu je lepší zvýšit počet biologických replikátů než sekvenovat pouze několik vzorků s velmi vysokou hloubkou.
Časté chyby
- použití pouze dvou vzorků na skupinu,
- považování technických replikátů za biologické,
- spojení všech jedinců do jednoho poolu,
- nahrazování replikátů hlubším sekvenováním,
- chybějící náhradní materiál pro případ vyřazení vzorku,
- příprava kontrolních a zkoumaných vzorků v různých šaržích,
- nezohlednění pohlaví, věku, genotypu nebo jiných zdrojů variability,
- považování buněk od jednoho dárce v scRNA-seq za nezávislé replikáty.
Naplánujte si projekt
Nejste si jisti a potřebujete konzultaci? Popište svůj projekt - navrhneme počet vzorků, metodu a množství dat.
Na základě uspořádání experimentu a typu materiálu vám pomůžeme určit počet biologických replikátů, způsob přípravy knihoven a vhodnou hloubku sekvenování.
Vybrané realizované projekty a publikace našich zákazníků
Podívejte se, pro které instituce provádíme sekvenování NGS a v jakých publikacích byla využita námi dodaná data.