Amplicon Seq

Amplicon sequencing je sekvenační technika založená na analýze specifických fragmentů DNA (amplikonů), které se amplifikují pomocí PCR. Nejčastěji se používá k identifikaci mikroorganismů ve zkoumaném materiálu analýzou vybraných oblastí genomu, jako jsou 16S rRNA (u bakterií), ITS (u hub), 18S (eukaryota).

Průběh procesu Amplicon Seq

Využití Amplicon Seq

Amplicon sequencing je oblíbený díky své přesnosti, relativně nízkým nákladům a možnosti analyzovat mnoho vzorků současně.

Technická charakteristika Amplicon Seq

Specifikace: Illumina

• Režim sekvenování: 2 × 250 bp
• Standardně dostupný objem dat na vzorek:
  • 30k párů čtení (tags)
  • 50k párů čtení (tags) - standardní, doporučený přístup
  • 100k párů čtení (tags)
  • Jiný / Nestandardní (na zvláštní přání zákazníka).
• Dostupné možnosti výběru oblasti pro amplifikaci:
  • 16S - identifikace bakterií:
    • V3+V4 - standardní přístup. Navrhované primery: 338F a 806R
    • V4+V5 - navrhované primery: 515F a 926R
    • V4 - navrhované primery: 515F a 806R2
    • Archea V3+V4 - navrhované primery: Arch349F a Arch806R
  • ITS - identifikace hub:
    • ITS1 - standardní přístup. Navrhované primery: ITS1F a ITS2
    • ITS2 - Doporučené primery: ITS2F a ITS2R.
  • 18S - identifikace eukaryotické ribozomální RNA:
    • V4 - Doporučené primery: TAReuk454FWD1 a TAReukREV3
    • V7 - Doporučené primery: 960F a NSR1438

• Doporučené požadavky na vzorky (Illumina):
  • Typ vzorku: gDNA
  • Množství: > 500 ng
  • Koncentrace (NanoDrop): >20 ng/μL
  • Objem: >20 μL
  • Čistota (OD260/280): 1,6 - 2,5
• MINIMÁLNÍ požadavky na vzorky (Illumina):
  • Typ vzorku: gDNA
  • Množství: > 300 ng
  • Koncentrace (Qubit): >1 ng/μL
  • Objem: >20 μL

Z dodaných vzorků je možná také izolace DNA. Podrobnosti zde.

Specifikace: PacBio

• Dlouhá čtení, HiFi
• Standardní objemy dat na vzorek na výběr:
  • 10k párů čtení (tags)
  • 30k párů čtení (tags)
  • 50k párů čtení (tags)
  • Jiný / nestandardní (na zvláštní přání zákazníka).
• Dostupné možnosti výběru oblasti pro amplifikaci:
  • 16S (celý úsek o délce přibližně 1,5 Kb, od V1 do V9). Doporučené primery: 27F a 1492R
  • ITS (celý úsek o délce přibližně 0,5-0,7 Kb, od ITS1 do ITS2). Doporučené primery: ITS1 a ITS4
  • 18S (celý úsek o délce přibližně 1,8 Kb). Doporučené primery: Euk-A a Euk-B
• Doporučené požadavky na vzorky (PacBio):
  • Typ vzorku: gDNA
  • Množství: > 1500 ng
  • Koncentrace (NanoDrop): >50 ng/μL
  • Objem: >20 μL
  • Čistota (OD260/280): 1,6 - 2,5
• MINIMÁLNÍ požadavky na vzorky (PacBio):
  • Typ vzorku: gDNA
  • Množství: > 1000 ng
  • Koncentrace (Qubit): >20 ng/μL
  • Objem: >20 μL

Z dodaných vzorků je možná také izolace DNA. Podrobnosti zde.

Bioinformatická analýza sekvenování amplikonů

Pokročilá bioinformatická analýza v rámci balíčku sekvenování amplikonů zahrnuje mimo jiné:

• Analýza OTU/ASV
• Taxonomická anotace a relativní abundance
• Analýza alfa diverzity
• Analýza beta diverzity
• Diferenciální analýza mezi skupinami
• Korelační analýza
• Predikce funkčních genů 16S / ITS / 18S