Pro sestavování velkých eukaryotických genomů je v současnosti nejlepším výchozím řešením PacBio HiFi, které kombinuje dlouhá čtení s vysokou přesností. Oxford Nanopore se vyplatí zvolit, pokud jsou prioritou velmi dlouhá čtení a rozlišení repetitivních oblastí, zatímco Illumina se uplatňuje především při genome survey (orientační analýze genomu), kontrole kvality a v projektech zaměřených na malé, jednoduché genomy.
Pokud je cílem kvalitní referenční genom na úrovni chromozomů, nejčastěji se doporučuje hybridní přístup: PacBio HiFi + Hi-C, případně doplněný o ultradlouhá čtení ONT a data Illumina.
Porovnání technologií
| Technologie | Největší výhoda | Hlavní omezení | Nejvhodnější využití |
|---|---|---|---|
| Illumina | Velmi přesná a levná krátká čtení | Obtíže s repeticemi a haplotypy | Genome survey (orientační analýza genomu), malé genomy, doplňková kontrola |
| PacBio HiFi | Dlouhá a velmi přesná čtení | Vyžaduje kvalitní vysokomolekulární DNA | Sestavování referenčního genomu de novo |
| Oxford Nanopore | Velmi dlouhá a ultradlouhá čtení | Výsledek výrazně závisí na kvalitě vysokomolekulární DNA | Repetice, centromery, telomery, T2T |
| Hybridní přístup | Nejvyšší úplnost a kontinuita | Vyšší náklady a větší množství materiálu | Genom na úrovni chromozomů |
Kdy zvolit Illumina?
Illumina je vhodná, pokud:
- chcete provést orientační analýzu genomu - genome survey,
- potřebujete odhadnout velikost genomu, heterozygotnost a podíl repetic,
- analyzujete malý a málo složitý bakteriální genom,
- mají data sloužit k doplňkové kontrole nebo korekci sestaveného genomu,
- máte k dispozici DNA, která nesplňuje požadavky pro sekvenování dlouhých čtení.
Illumina může postačovat k vytvoření pracovní sestavy malého genomu. U velkých rostlinných a živočišných genomů krátká čtení obvykle neumožňují správně charakterizovat repetitivní oblasti, duplikace a haplotypy.
Kdy zvolit PacBio HiFi?
PacBio HiFi se doporučuje, pokud:
- je cílem kvalitní sestavení genomu de novo,
- je genom velký, heterozygotní nebo polyploidní,
- je potřeba rozlišit haplotypy,
- je důležitá vysoká přesnost na úrovni jednotlivých bází,
- budou analyzovány strukturní varianty,
- genom obsahuje četné repetice a duplikace.
PacBio HiFi je často nejlepším základem pro sestavení nového referenčního genomu (de novo). Pro uspořádání kontigů do chromozomů je třeba data HiFi doplnit o Hi-C.
Kdy zvolit Oxford Nanopore?
ONT se vyplatí zvolit, pokud:
- je zásadní maximální délka čtení,
- je cílem rozlišit velmi dlouhé repetice,
- jsou analyzovány centromery, telomery nebo segmentální duplikace,
- projekt směřuje k sestavení genomu telomere-to-telomere,
- je důležitá identifikace rozsáhlých přestaveb,
- je k dispozici velmi kvalitní DNA s ultravysokou molekulovou hmotností.
ONT lze použít samostatně nebo jako doplněk PacBio HiFi. I střední hloubka pokrytí ultradlouhými čteními může pomoci propojit oblasti, které se pomocí kratších čtení nepodařilo rozlišit.
Kdy zvolit hybridní přístup?
Hybridní přístup je nejlepší volbou, pokud je cílem získat kompletní genom 0-gap.
Nejčastější kombinace jsou:
Současná data PacBio HiFi často nevyžadují dodatečné zpřesňování pomocí dat Illumina. Krátká čtení však zůstávají užitečná pro genome survey (orientační analýzu genomu) a nezávislou kontrolu sestaveného genomu.
Požadavky na vzorky
Illumina
- purifikovaná genomová DNA,
- obvykle alespoň přibližně 1 µg,
- koncentrace od přibližně 30 ng/µL,
- zachování ultradlouhých fragmentů není vyžadováno.
PacBio HiFi
- vysokomolekulární DNA - HMW DNA,
- obvykle několik až necelých dvacet mikrogramů, v závislosti na protokolu,
- vysoká čistota a integrita,
- minimální fragmentace způsobená izolací a/nebo přepravou,
- upřednostňuje se čerstvý nebo správně zmrazený materiál.
Oxford Nanopore
- HMW nebo ultra-HMW DNA,
- obvykle několik mikrogramů nebo více,
- velmi vysoká čistota,
- zákaz intenzivního pipetování a vortexování vzorků,
- vhodná metoda izolace zvolená podle očekávané délky čtení.
Přesné požadavky závisí na velikosti genomu, technologii a počtu plánovaných knihoven. Způsob odběru a izolace je nejlepší konzultovat ještě před zahájením experimentu.
Orientační objem dat
| Typ dat | Orientační hloubka pokrytí |
|---|---|
| Illumina genome survey (orientační analýza genomu) | přibližně 30-50×, doporučuje se i ≥50× |
| PacBio HiFi de novo | přibližně 25-30× |
| PacBio HiFi na haplotyp | přibližně 10-15× na haplotyp |
| ONT dlouhá čtení | přibližně 30-40× |
| ONT ultradlouhá čtení jako doplněk | přibližně 5-15× |
| Hi-C | volí se podle velikosti a složitosti genomu |
Množství dat se vypočítá podle vzorce:
velikost genomu × plánovaná hloubka pokrytí = požadované množství dat
Příklad: genom o velikosti 1 Gb při hloubce pokrytí 30× vyžaduje přibližně 30 Gb dat.
U polyploidních, vysoce heterozygotních genomů nebo genomů bohatých na repetice může být zapotřebí větší hloubka pokrytí.
Časté chyby
- volba sekvenování založeného pouze na technologii Illumina pro velký genom s velkým množstvím repetitivních sekvencí,
- zahájení projektu bez odhadu velikosti genomu a heterozygotnosti,
- dodání degradované DNA pro PacBio nebo ONT,
- intenzivní pipetování a opakované zmrazování vysokomolekulární DNA,
- nezohlednění ploidie a hybridního původu,
- vynechání Hi-C při požadavku na sestavení genomu na úrovni chromozomů,
- sekvenování DNA pocházející od více geneticky odlišných jedinců.
Kvalitu genomu je třeba hodnotit také z hlediska úplnosti, přesnosti, počtu mezer, přítomnosti kontaminace a správného oddělení haplotypů.
Otázky při plánování projektu
Naplánujte si projekt
Máte pochybnosti? Popište nám svůj projekt a my vám pomůžeme zvolit vhodnou technologii, množství dat a počet vzorků.