mRNA-seq, nebo sekvenování celkové RNA? Kterou metodu zvolit?

mRNA-seq se selekcí poly(A) je nejlepší volbou, pokud je cílem analýza exprese genů kódujících proteiny u eukaryotických organismů. Sekvenování celkové RNA s deplecí rRNA zvolte, pokud projekt zahrnuje také lncRNA, transkripty bez poly(A) konce, circRNA, degradovaný materiál nebo transkriptom prokaryotických organismů.

Porovnání metod

Kdy zvolit mRNA-seq se selekcí poly(A)?

Zvolte poly(A), pokud:

• hlavním cílem je analýza exprese genů kódujících proteiny,
• plánujete analýzu diferenciální exprese genů (detekci DEG),
• chcete analyzovat alternativní sestřih a izoformy mRNA,
• zkoumaný materiál pochází z eukaryotického organismu,
• vzorky obsahují RNA s dobrou integritou,
• záleží vám na vysokém podílu čtení přiřazených k mRNA.

Selekce poly(A) využívá magnetické kuličky potažené oligo(dT), které vážou poly(A) konce přítomné u většiny zralých eukaryotických mRNA. Knihovna je tak obohacena o transkripty kódující proteiny.

Kdy zvolit sekvenování celkové RNA s deplecí rRNA?

Zvolte depleci rRNA, pokud:

• potřebujete široký přehled o transkriptomu,
• analyzujete mRNA i lncRNA,
• zajímají vás transkripty bez poly(A) ocasu,
• plánujete analýzu circRNA,
• materiál je částečně degradovaný, např. pochází z archivních vzorků nebo FFPE,
• analyzujete transkriptom bakterií nebo archeí,
• vzorek obsahuje RNA pocházející od hostitele i mikroorganismů.

Při tomto postupu se z celkové RNA odstraňuje rRNA, která může tvořit až přibližně 80-90 % vzorku. Ostatní frakce RNA zůstávají zachovány a mohou být zahrnuty do přípravy knihovny.

Požadavky na vzorky

mRNA-seq - poly(A)

Doporučené parametry:

• materiál: celková RNA,
• množství: více než 0,5 µg,
• koncentrace: více než 50 ng/µL,
• objem: více než 20 µL,
• OD260/280: 1,8-2,2,
• RIN: vyšší než 7, u rostlin vyšší než 6.

Minimální parametry:

• množství: více než 0,2 µg,
• koncentrace měřená přístrojem Qubit: více než 20 ng/µL,
• objem: více než 20 µL,
• OD260/280: 1,7-2,5,
• RIN: vyšší než 4,5, u rostlin vyšší než 4.

Sekvenování celkové RNA - deplece rRNA

Doporučené parametry:

• materiál: celková RNA,
• množství: více než 2 µg,
• koncentrace: více než 100 ng/µL,
• objem: více než 10 µL,
• OD260/280: 1,8-2,2,
• RIN: vyšší než 7, u rostlin vyšší než 6.

Minimální parametry:

• množství: více než 500 ng,
• koncentrace měřená přístrojem Qubit: více než 80 ng/µL,
• objem: více než 10 µL,
• OD260/280: 1,7-2,5,
• RIN: více než 6,5, u rostlin více než 6.

Požadavky se mohou lišit podle organismu, kvality materiálu a zvolené soupravy pro přípravu knihoven. Vzorky, které nesplňují standardní kritéria, včetně materiálu s nízkým vstupním množstvím, vyžadují individuální posouzení.

Orientační objem dat

Pro standardní sekvenování mRNA se selekcí poly(A) jsou k dispozici tyto varianty:

• 6 Gb na vzorek,
• 10 Gb na vzorek,
• 15 Gb na vzorek.

Pro sekvenování celkové RNA s deplecí rRNA je doporučené množství dat vyšší:

• 12 Gb na vzorek,
• 16 Gb na vzorek - doporučená varianta, pokud projekt zahrnuje také analýzu circRNA.

Konečné množství dat závisí mimo jiné na velikosti a složitosti transkriptomu, typu materiálu, cíli analýzy a požadované citlivosti detekce nízce exprimovaných transkriptů.

Časté chyby při výběru metody

Otázky pro zadání projektu

Před přípravou cenové nabídky a naplánováním experimentu shromážděte tyto informace:

Naplánujte si projekt

Popište projekt - vybereme vhodnou metodu a množství dat.