10x Genomics RNA-seq

Single-Nucleus oraz Single-Cell RNA Sequencing, to metody umożliwiająca analizę ekspresji genów na poziomie pojedynczych jąder komórkowych. Pozwala scharakteryzować heterogeniczność złożonych tkanek, identyfikować typy i subpopulacje komórek oraz określać charakterystyczne dla nich profile ekspresji genów. W przeciwieństwie do klasycznego RNA-seq, w którym uzyskuje się uśredniony profil ekspresji dla całej próbki, snRNA-seq umożliwia rozdzielenie sygnału pochodzącego z poszczególnych populacji komórkowych. Dzięki temu możliwa jest identyfikacja również rzadkich subpopulacji, których obecność może zostać zamaskowana podczas analizy całej tkanki. Metoda wykorzystuje technologię 10x Genomics Chromium do rozdzielania pojedynczych jąder i znakowania pochodzących z nich cząsteczek RNA indywidualnymi kodami kreskowymi. Jest szczególnie przydatna w przypadku materiału mrożonego, tkanek trudnych do dysocjacji oraz próbek, z których nie można uzyskać dobrej jakości zawiesiny całych komórek

Przebieg procesu 10x Genomics RNA-seq

Zastosowanie 10x Genomics RNA-seq

Single-Nucleus RNA-seq czy Single-Cell RNA-seq?

Wybór pomiędzy analizą pojedynczych jąder a analizą całych komórek zależy przede wszystkim od rodzaju i sposobu zabezpieczenia materiału biologicznego.

Single-Nucleus RNA Sequencing:

• umożliwia analizę materiału mrożonego,
• może być stosowane w przypadku tkanek trudnych do rozdzielenia na pojedyncze komórki,
• nie jest ograniczone rozmiarem całych komórek w takim stopniu jak scRNA-seq,
• może ograniczać zmiany ekspresji indukowane długotrwałym trawieniem enzymatycznym,
• pozwala analizować duże, kruche lub wielojądrowe komórki,
• obejmuje przede wszystkim RNA obecne w jądrze komórkowym.

Single-Cell RNA Sequencing:

• wymaga zazwyczaj świeżego materiału,
• wymaga przygotowania dobrej jakości zawiesiny pojedynczych, żywych komórek,
• obejmuje RNA obecne zarówno w jądrze, jak i cytoplazmie,
• może być ograniczone wielkością i podatnością komórek na uszkodzenie,
• enzymatyczna dysocjacja tkanki może wywoływać odpowiedź stresową i zmieniać profil ekspresji genów.

W snRNA-seq analizowany jest transkryptom jądrowy, dlatego uzyskany profil nie jest identyczny z profilem całej komórki. Wybór metody powinien uwzględniać charakter tkanki, sposób przechowywania próbek i biologiczny cel projektu.

Charakterystyka techniczna 10x Genomics RNA-seq

Parametry sekwencjonowania oraz docelowa liczba jąder/komórek powinny zostać dobrane indywidualnie do rodzaju materiału i celu eksperymentu. 

Wymagania dotyczące próbek

Orientacyjne wymagania dotyczące ilości materiału:

• tkanka zwierzęca: co najmniej 200 mg,
• tkanka roślinna: co najmniej 400 mg.

Podane wartości mają charakter orientacyjny. Rzeczywista wymagana ilość materiału zależy między innymi od rodzaju tkanki, wielkości i liczby jąder komórkowych / komórek, zawartości tkanki łącznej, obecności metabolitów wtórnych, sposobu przechowywania oraz oczekiwanej liczby analizowanych jąder/komórek.

Przed rozpoczęciem projektu zalecamy konsultację dotyczącą rodzaju materiału, sposobu jego pobrania, zabezpieczenia i transportu.

Analiza bioinformatyczna 10x Genomics RNA-seq

Analiza bioinformatyczna może obejmować:

• Kontrola jakości danych:
  • ocenę jakości surowych odczytów,
  • kontrolę jakości biblioteki,
  • ocenę nasycenia sekwencjonowania,
  • statystyki liczby analizowanych jąder/komórek,
  • ocenę liczby odczytów przypadających na jądro/komórkę,
  • ocenę liczby wykrytych genów i cząsteczek UMI,
  • identyfikację jąder niespełniających kryteriów jakościowych.
• Analiza ekspresji genów:
  • mapowanie odczytów do genomu referencyjnego,
  • przypisanie odczytów do genów i poszczególnych jąder/komórek,
  • utworzenie macierzy ekspresji genów,
  • kwantyfikację i analizę rozkładu ekspresji genów,
  • normalizację i filtrowanie danych.
• Klasteryzacja i identyfikacja populacji komórkowych:
  • redukcję wymiarowości danych,
  • grupowanie jąder na podstawie profili ekspresji,
  • wizualizację wyników za pomocą UMAP lub t-SNE,
  • identyfikację genów markerowych poszczególnych klastrów,
  • identyfikację znanych typów komórek,
  • charakterystykę subpopulacji i stanów komórkowych.
• Klasteryzacja i identyfikacja populacji komórkowych:
  • redukcję wymiarowości danych,
  • grupowanie jąder na podstawie profili ekspresji,
  • wizualizację wyników za pomocą UMAP lub t-SNE,
  • identyfikację genów markerowych poszczególnych klastrów,
  • identyfikację znanych typów komórek,
  • charakterystykę subpopulacji i stanów komórkowych.
• Analiza różnicowej ekspresji:
  • identyfikację genów różnicowo eksprymowanych pomiędzy klastrami,
  • porównanie ekspresji pomiędzy grupami eksperymentalnymi,
  • hierarchiczne grupowanie genów o zróżnicowanej ekspresji,
  • analizę genów markerowych dla poszczególnych populacji komórkowych.
• Analiza funkcjonalna:
  • adnotację funkcjonalną genów,
  • analizę wzbogacenia procesów biologicznych i szlaków metabolicznych,
  • predykcję czynników transkrypcyjnych związanych z genami różnicowo eksprymowanymi,
  • analizę interakcji białkowych,
  • analizę funkcjonalną genów markerowych poszczególnych klastrów,
  • adnotację genów z wykorzystaniem odpowiednich baz danych.

Dokładny zakres analizy bioinformatycznej ustalany jest indywidualnie i zależy od organizmu, dostępności wysokiej jakości genomu referencyjnego, liczby próbek oraz celu projektu.