Single-Nucleus oraz Single-Cell RNA Sequencing, to metody umożliwiająca analizę ekspresji genów na poziomie pojedynczych jąder komórkowych. Pozwala scharakteryzować heterogeniczność złożonych tkanek, identyfikować typy i subpopulacje komórek oraz określać charakterystyczne dla nich profile ekspresji genów. W przeciwieństwie do klasycznego RNA-seq, w którym uzyskuje się uśredniony profil ekspresji dla całej próbki, snRNA-seq umożliwia rozdzielenie sygnału pochodzącego z poszczególnych populacji komórkowych. Dzięki temu możliwa jest identyfikacja również rzadkich subpopulacji, których obecność może zostać zamaskowana podczas analizy całej tkanki. Metoda wykorzystuje technologię 10x Genomics Chromium do rozdzielania pojedynczych jąder i znakowania pochodzących z nich cząsteczek RNA indywidualnymi kodami kreskowymi. Jest szczególnie przydatna w przypadku materiału mrożonego, tkanek trudnych do dysocjacji oraz próbek, z których nie można uzyskać dobrej jakości zawiesiny całych komórek
Przebieg procesu 10x Genomics RNA-seq
Zastosowanie 10x Genomics RNA-seq
- identyfikacji typów i subpopulacji komórek tworzących złożone tkanki,
- analizie heterogeniczności komórkowej,
- identyfikacji rzadkich populacji komórek,
- badaniu rozwoju i różnicowania komórek,
- analizie odpowiedzi poszczególnych populacji komórkowych na leczenie lub warunki eksperymentalne,
- badaniu heterogeniczności nowotworów i ich mikrośrodowiska,
- analizie tkanek nerwowych i mózgu,
- badaniu tkanek zawierających duże lub delikatne komórki,
- tworzeniu atlasów komórkowych tkanek i narządów,
- analizie odpowiednio zabezpieczonego materiału mrożonego.
Single-Nucleus RNA-seq czy Single-Cell RNA-seq?
Wybór pomiędzy analizą pojedynczych jąder a analizą całych komórek zależy przede wszystkim od rodzaju i sposobu zabezpieczenia materiału biologicznego.
Single-Nucleus RNA Sequencing:
- umożliwia analizę materiału mrożonego,
- może być stosowane w przypadku tkanek trudnych do rozdzielenia na pojedyncze komórki,
- nie jest ograniczone rozmiarem całych komórek w takim stopniu jak scRNA-seq,
- może ograniczać zmiany ekspresji indukowane długotrwałym trawieniem enzymatycznym,
- pozwala analizować duże, kruche lub wielojądrowe komórki,
- obejmuje przede wszystkim RNA obecne w jądrze komórkowym.
Single-Cell RNA Sequencing:
- wymaga zazwyczaj świeżego materiału,
- wymaga przygotowania dobrej jakości zawiesiny pojedynczych, żywych komórek,
- obejmuje RNA obecne zarówno w jądrze, jak i cytoplazmie,
- może być ograniczone wielkością i podatnością komórek na uszkodzenie,
- enzymatyczna dysocjacja tkanki może wywoływać odpowiedź stresową i zmieniać profil ekspresji genów.
W snRNA-seq analizowany jest transkryptom jądrowy, dlatego uzyskany profil nie jest identyczny z profilem całej komórki. Wybór metody powinien uwzględniać charakter tkanki, sposób przechowywania próbek i biologiczny cel projektu.
Charakterystyka techniczna usługi 10x Genomics RNA-seq
Parametry sekwencjonowania oraz docelowa liczba jąder/komórek powinny zostać dobrane indywidualnie do rodzaju materiału i celu eksperymentu.
Wymagania dotyczące próbek
Orientacyjne wymagania dotyczące ilości materiału:
- tkanka zwierzęca: co najmniej 200 mg,
- tkanka roślinna: co najmniej 400 mg.
Podane wartości mają charakter orientacyjny. Rzeczywista wymagana ilość materiału zależy między innymi od rodzaju tkanki, wielkości i liczby jąder komórkowych / komórek, zawartości tkanki łącznej, obecności metabolitów wtórnych, sposobu przechowywania oraz oczekiwanej liczby analizowanych jąder/komórek.
Przed rozpoczęciem projektu zalecamy konsultację dotyczącą rodzaju materiału, sposobu jego pobrania, zabezpieczenia i transportu.
Analiza bioinformatyczna 10x Genomics snRNA-seq
Analiza bioinformatyczna może obejmować:
- Kontrola jakości danych:
- ocenę jakości surowych odczytów,
- kontrolę jakości biblioteki,
- ocenę nasycenia sekwencjonowania,
- statystyki liczby analizowanych jąder/komórek,
- ocenę liczby odczytów przypadających na jądro/komórkę,
- ocenę liczby wykrytych genów i cząsteczek UMI,
- identyfikację jąder niespełniających kryteriów jakościowych.
- Analiza ekspresji genów:
- mapowanie odczytów do genomu referencyjnego,
- przypisanie odczytów do genów i poszczególnych jąder/komórek,
- utworzenie macierzy ekspresji genów,
- kwantyfikację i analizę rozkładu ekspresji genów,
- normalizację i filtrowanie danych.
- Klasteryzacja i identyfikacja populacji komórkowych:
- redukcję wymiarowości danych,
- grupowanie jąder na podstawie profili ekspresji,
- wizualizację wyników za pomocą UMAP lub t-SNE,
- identyfikację genów markerowych poszczególnych klastrów,
- identyfikację znanych typów komórek,
- charakterystykę subpopulacji i stanów komórkowych.
- Klasteryzacja i identyfikacja populacji komórkowych:
- redukcję wymiarowości danych,
- grupowanie jąder na podstawie profili ekspresji,
- wizualizację wyników za pomocą UMAP lub t-SNE,
- identyfikację genów markerowych poszczególnych klastrów,
- identyfikację znanych typów komórek,
- charakterystykę subpopulacji i stanów komórkowych.
- Analiza różnicowej ekspresji:
- identyfikację genów różnicowo eksprymowanych pomiędzy klastrami,
- porównanie ekspresji pomiędzy grupami eksperymentalnymi,
- hierarchiczne grupowanie genów o zróżnicowanej ekspresji,
- analizę genów markerowych dla poszczególnych populacji komórkowych.
- Analiza funkcjonalna:
- adnotację funkcjonalną genów,
- analizę wzbogacenia procesów biologicznych i szlaków metabolicznych,
- predykcję czynników transkrypcyjnych związanych z genami różnicowo eksprymowanymi,
- analizę interakcji białkowych,
- analizę funkcjonalną genów markerowych poszczególnych klastrów,
- adnotację genów z wykorzystaniem odpowiednich baz danych.
Dokładny zakres analizy bioinformatycznej ustalany jest indywidualnie i zależy od organizmu, dostępności wysokiej jakości genomu referencyjnego, liczby próbek oraz celu projektu.
Polish 
English