Spatial Transcriptomics

Transkryptomika przestrzenna (Spatial Transcriptomics) to zaawansowana metoda analizy ekspresji genów, która pozwala zachować informację o pierwotnym położeniu transkryptów w obrębie badanego fragmentu tkanki. W przeciwieństwie do klasycznego RNA-seq, w którym RNA izolowane jest z homogenizowanego materiału, transkryptomika przestrzenna łączy dane dotyczące ekspresji genów z obrazem histologicznym próbki. Dzięki temu możliwe jest określenie, które geny są aktywne w poszczególnych regionach tkanki, identyfikacja obszarów o odmiennych profilach molekularnych oraz analiza zależności pomiędzy strukturą tkanki a zachodzącymi w niej procesami biologicznymi. Metoda może być stosowana zarówno do analizy tkanek zwierzęcych, jak i roślinnych. Jest szczególnie przydatna w badaniach, w których przestrzenna organizacja komórek i struktur tkankowych ma kluczowe znaczenie dla prawidłowej interpretacji wyników.

Zastosowanie transkryptomiki przestrzennej

Transkryptomika przestrzenna znajduje zastosowanie między innymi w:

• analizie molekularnej organizacji tkanek i narządów,
• identyfikacji przestrzennie zróżnicowanych regionów tkanki,
• badaniu mikrośrodowiska nowotworowego,
• analizie naciekania tkanek przez komórki układu odpornościowego,
• badaniach układu nerwowego i organizacji poszczególnych obszarów mózgu,
• analizie rozwoju zarodkowego i organogenezy,
• badaniach różnicowania komórek,
• analizie regeneracji i naprawy tkanek,
• porównywaniu przestrzennych profili ekspresji genów pomiędzy grupami eksperymentalnymi,
• badaniu organizacji molekularnej organów i struktur roślinnych,
• identyfikacji genów aktywnych w określonych warstwach,
• regionach lub typach tkanek,
• integracji danych przestrzennych z wynikami single-cell RNA-seq oraz innymi danymi omicznymi.

Metoda jest szczególnie cenna w onkologii, immunologii, neurobiologii, biologii rozwoju, badaniach regeneracyjnych oraz w analizach złożonych tkanek roślinnych i zwierzęcych.

Przebieg procesu transkryptomiki przestrzennej

Parametry techniczne

Ostateczna ilość danych może zostać dostosowana do rodzaju tkanki, powierzchni zajmowanej przez próbkę, złożoności transkryptomu oraz celu projektu.

Wymagania dotyczące próbek zwierzęcych

• Materiał powinien zostać pobrany od żywego lub niedawno uśmierconego organizmu i możliwie szybko zabezpieczony. Przed zatopieniem należy usunąć nadmiar tkanki łącznej, tłuszczowej, krwi oraz inne elementy, które nie będą przedmiotem analizy.
• Powierzchnię próbki należy delikatnie przemyć schłodzonym, wolnym od RNaz buforem PBS lub solą fizjologiczną, a następnie ostrożnie osuszyć.
• W przypadku próbek nowotworowych należy prawidłowo rozdzielić tkankę guza od tkanki przylegającej. Większe fragmenty powinny zostać przycięte do wymiarów odpowiadających powierzchni obszaru wychwytującego.
• Zalecane jest przygotowanie co najmniej dwóch bloków OCT dla każdej próbki:
  • pierwszego do kontroli jakości, wyboru odpowiedniego skrawka, optymalizacji permeabilizacji i właściwego eksperymentu,
  • drugiego jako materiału zapasowego.
• Dla większości tkanek zwierzęcych odpowiednie jest szybkie zamrażanie na suchym lodzie. W przypadku niewielkich biopsji, mózgu, tkanek obrzękowych oraz materiałów podatnych na powstawanie kryształów lodu rekomendowane może być zamrażanie w izopentanie schłodzonym ciekłym azotem.
• Jeżeli natychmiastowe zatopienie materiału nie jest możliwe, tkankę można tymczasowo przechowywać w temperaturze 4°C w odpowiednim buforze lub roztworze do przechowywania tkanek. Czas takiego przechowywania powinien być możliwie krótki, ponieważ może wpływać na integralność RNA.

Wymagania dotyczące próbek roślinnych

• Świeży materiał roślinny powinien być pobierany za pomocą czystych, wolnych od RNaz narzędzi, najlepiej schłodzonych do około 4°C. Z powierzchni próbki należy usunąć glebę, podłoże hodowlane oraz inne zanieczyszczenia.
• Tkankę można delikatnie przepłukać ultraczystą wodą, a następnie usunąć elementy, które nie będą przedmiotem analizy. Podczas przygotowania należy zachować prawidłową strukturę i orientację wybranego fragmentu.
• Ze względu na różnice w budowie tkanek roślinnych sposób zatapiania powinien być dostosowany do rodzaju materiału.
  • Tkanki zawierające przestrzenie lub jamy, takie jak młode pąki, pąki kwiatowe, nasiona, łodygi i niektóre korzenie, mogą wymagać próżniowej infiltracji rozcieńczonym OCT przed zamrożeniem.
  • Tkanki pozbawione większych przestrzeni, takie jak liście, korzenie boczne, wierzchołki korzeniowe lub kalus, mogą być bezpośrednio zatapiane w OCT i szybko zamrażane na suchym lodzie.
• W przypadku dostępności odpowiedniej ilości materiału zalecane jest przygotowanie od trzech do pięciu bloków dla każdej próbki. Jest to szczególnie ważne w przypadku cienkich, delikatnych lub trudnych do prawidłowego orientowania struktur roślinnych. Dodatkowe bloki mogą być potrzebne do:
  • kontroli jakości RNA,
  • oceny struktury tkanki,
  • wyboru odpowiedniego poziomu skrawania,
  • optymalizacji permeabilizacji,
  • przeprowadzenia właściwego eksperymentu.

Zatapianie próbek w OCT

Tkanka powinna być całkowicie otoczona przez OCT i umieszczona zgodnie z planowanym kierunkiem cięcia. Nieprawidłowa orientacja próbki, obecność pęcherzyków powietrza lub fałdowanie materiału może utrudnić przygotowanie skrawków i zmniejszyć powierzchnię dostępną do analizy.

Jeżeli w jednym bloku zatapianych jest kilka niewielkich fragmentów, powinny one:

• znajdować się na tej samej płaszczyźnie,
• być ułożone blisko siebie, ale bez nakładania,
• łącznie zajmować co najmniej około 25% obszaru wychwytującego,
• znajdować się z dala od krawędzi i dna foremki.

Przechowywanie i transport

Bloki zatopione w OCT powinny być odpowiednio opisane, zabezpieczone folią aluminiową lub szczelnym opakowaniem i przechowywane w temperaturze −80°C lub w ciekłym azocie. Transport powinien odbywać się na suchym lodzie, bez dopuszczenia do rozmrożenia próbek. Nawet krótkotrwałe rozmrożenie może pogorszyć morfologię tkanki i jakość RNA.

Kontrola jakości skrawków

Przed wykonaniem właściwego eksperymentu oceniana jest jakość morfologiczna tkanki oraz integralność RNA. Ocena morfologiczna pozwala potwierdzić, że:

• w skrawku obecny jest właściwy region tkanki,
• struktura tkanki została zachowana,
• próbka nie zawiera znacznych pęknięć, zagięć ani zmarszczeń,
• nie występują duże pęcherzyki powietrza,
• nie są widoczne istotne artefakty powstałe podczas zamrażania.

W przypadku tkanek zwierzęcych zazwyczaj stosowane jest barwienie H&E, natomiast dla tkanek roślinnych może zostać wykorzystane barwienie błękitem toluidynowym. RNA izolowane z reprezentatywnych skrawków oceniane jest za pomocą urządzenia Agilent 2100 Bioanalyzer lub równoważnego systemu. Do dalszej realizacji projektu rekomendowana jest wartość RIN wynosząca co najmniej 6.

Analiza bioinformatyczna

Standardowa analiza bioinformatyczna obejmuje:

• kontrolę jakości i ocenę danych sekwencyjnych,
• mapowanie odczytów do genomu referencyjnego,
• identyfikację i ilościowe oznaczenie genów w poszczególnych punktach przestrzennych,
• ocenę pokrycia tkanki,
• określenie liczby genów wykrywanych w poszczególnych punktach,
• integrację wyników sekwencjonowania z obrazem histologicznym,
• wizualizację przestrzennych profili ekspresji genów,
• klasteryzację punktów na podstawie ich profili ekspresji,
• identyfikację genów charakterystycznych dla poszczególnych klastrów,
• analizę genów różnicujących klastry i regiony tkanki,
• funkcjonalną adnotację genów,
• analizę wzbogacenia funkcjonalnego,
• integrację danych pochodzących z wielu próbek,
• wspólną klasteryzację danych przestrzennych,
• analizę różnic pomiędzy grupami eksperymentalnymi.

Zakres analizy może zostać rozszerzony o dodatkowe analizy niestandardowe, integrację z danymi single-cell RNA-seq oraz wizualizacje dostosowane do celu projektu i specyfiki badanego materiału.