Single-Cell ATAC-seq, czyli scATAC-seq, to metoda umożliwiająca analizę dostępności chromatyny na poziomie pojedynczych komórek. Pozwala identyfikować otwarte regiony chromatyny, w tym potencjalnie aktywne promotory, enhancery i miejsca wiązania czynników transkrypcyjnych.
W przeciwieństwie do klasycznego ATAC-seq, który dostarcza uśrednionego profilu dla całej próbki, scATAC-seq pozwala rozdzielić sygnał pochodzący z poszczególnych populacji komórkowych. Dzięki temu umożliwia analizę heterogenicznych tkanek, identyfikację rzadkich subpopulacji oraz porównanie mechanizmów regulacji genów między różnymi typami i stanami komórek.
Przebieg procesu Single-Cell ATAC-seq
- Przygotowanie materiału i usuwanie martwych komórekOceniane są liczba komórek, ich żywotność oraz jakość dostarczonej zawiesiny. Jeżeli udział martwych komórek jest wysoki, możliwe jest ich usunięcie z wykorzystaniem metody opartej na kulkach magnetycznych. Pozwala to wzbogacić próbkę w żywe komórki i poprawić jakość materiału przeznaczonego do izolacji jąder.
- Izolacja jąder i rozdzielanie materiałuZ komórek przygotowywana jest jednorodna zawiesina jąder komórkowych. Następnie dostępne regiony chromatyny są znakowane za pomocą transpozazy Tn5, która fragmentuje DNA i dołącza adaptery sekwencyjne. Jądra są rozdzielane w systemie mikroprzepływowym wraz z nośnikami zawierającymi oligonukleotydy kodujące.
- Znakowanie i przygotowanie bibliotekFragmenty DNA pochodzące z każdego jądra otrzymują unikalny kod kreskowy. Dzięki temu po sekwencjonowaniu możliwe jest przypisanie odczytów do poszczególnych komórek. Oznakowane fragmenty DNA są następnie amplifikowane i wykorzystywane do przygotowania bibliotek sekwencyjnych.
- SekwencjonowanieBiblioteki są łączone w pulę i sekwencjonowane na wysokoprzepustowej platformie Illumina. Sekwencjonowanie w układzie paired-end umożliwia określenie pozycji oraz długości fragmentów dostępnej chromatyny.
- Analiza bioinformatycznaOdczyty są przypisywane do poszczególnych jąder na podstawie kodów kreskowych i mapowane do genomu referencyjnego. Analiza może obejmować kontrolę jakości danych, identyfikację regionów otwartej chromatyny, klasteryzację komórek, analizę różnicowej dostępności chromatyny oraz identyfikację potencjalnych motywów wiązania czynników transkrypcyjnych. Wyniki przedstawiane są w formie raportów, tabel i wizualizacji umożliwiających porównanie populacji komórkowych.
Zastosowanie Single-Cell ATAC-seq
ATAC-seq jako alternatywa dla ChIP-seq
ChIP-seq umożliwia identyfikację miejsc związanych z konkretnym czynnikiem transkrypcyjnym lub określoną modyfikacją histonów. Metoda wymaga jednak odpowiedniego, zwalidowanego przeciwciała, a jej zastosowanie może być ograniczone przez niewielką ilość materiału biologicznego. Jakość i swoistość przeciwciała mają bezpośredni wpływ na wiarygodność uzyskanych wyników. ATAC-seq nie wymaga przeciwciał i pozwala jednocześnie analizować cały krajobraz otwartej chromatyny. Na podstawie dostępności regionów regulatorowych, występujących w nich motywów sekwencyjnych oraz analizy footprintingu można wskazać potencjalne czynniki transkrypcyjne zaangażowane w badany proces. Single-Cell ATAC-seq dodatkowo pozwala przypisać te różnice do konkretnych populacji komórek. ATAC-seq nie zastępuje jednak ChIP-seq w bezpośrednim potwierdzaniu wiązania określonego białka do DNA. Jest szczególnie przydatny na etapie odkrywania potencjalnych regulatorów, zwłaszcza gdy lista czynników transkrypcyjnych nie jest jeszcze znana lub brakuje odpowiednich przeciwciał.
Wymagania dotyczące próbek
Materiałem wejściowym może być świeża lub odpowiednio zabezpieczona tkanka, zawiesina pojedynczych komórek albo przygotowana zawiesina jąder komórkowych. Kluczowe znaczenie ma uzyskanie jednorodnej zawiesiny jąder o zachowanej integralności, z niewielką liczbą agregatów i ograniczoną ilością fragmentów komórkowych. Wymagana ilość materiału oraz sposób jego zabezpieczenia zależą od rodzaju organizmu, tkanki i planowanej liczby analizowanych jąder.
Analiza bioinformatyczna Single-Cell ATAC-seq
- kontrolę jakości i filtrowanie danych;
- mapowanie odczytów do genomu referencyjnego;
- identyfikację regionów otwartej chromatyny;
- tworzenie profili dostępności chromatyny dla pojedynczych jąder;
- redukcję wymiarowości i klasteryzację komórek;
- identyfikację regionów różnicowo dostępnych;
- analizę promotorów i potencjalnych enhancerów;
- analizę motywów czynników transkrypcyjnych;
- przewidywanie aktywności genów;
- integrację z danymi single-cell RNA-seq;
- porównanie populacji komórkowych pomiędzy grupami eksperymentalnymi.
Celem poznania ceny usługi zalecamy wypełnienie formularza specyfikacji projektu.