Full-length Transcriptome Sequencing

Sekwencjonowanie pełnej długości transkryptów (Full-length Transcriptome Sequencing) to nowoczesna metoda analizy transkryptomu wykorzystująca technologie długich odczytów (long-read sequencing), umożliwiająca bezpośrednie odczytanie kompletnych cząsteczek mRNA od końca 5′ do 3′. W przeciwieństwie do klasycznego RNA–Seq opartego na krótkich odczytach, technologia Full-length Transcriptome Sequencing pozwala na identyfikację pełnych izoform transkryptów bez konieczności ich rekonstrukcji metodami bioinformatycznymi.

Dzięki zastosowaniu platform Pacific Biosciences (PacBio) oraz Oxford Nanopore Technologies (ONT), możliwe jest precyzyjne wykrywanie alternatywnego splicingu, alternatywnych miejsc poliadenylacji, nowych genów, długich niekodujących RNA (lncRNA) oraz innych złożonych elementów regulacji ekspresji genów.

Technologia ta znajduje zastosowanie zarówno w badaniach podstawowych, jak i projektach translacyjnych, genomice funkcjonalnej, biologii rozwoju, biologii roślin, mikrobiologii oraz medycynie.

Przebieg procesu Full-length Transcriptome Sequencing

1. Izolacja RNA: Pierwszym etapem jest izolacja całkowitego RNA o wysokiej integralności. Jakość materiału wejściowego ma kluczowe znaczenie dla powodzenia analizy pełnej długości transkryptów.
2. Tworzenie bibliotek: Dla obu platform przygotowywane są biblioteki full-length cDNA obejmujące pełną długość transkryptów.
3. Sekwencjonowanie: W Pac-Bio: technologia Circular Consensus Sequencing (CCS) umożliwia wielokrotne odczytanie tej samej cząsteczki DNA i wygenerowanie odczytów o wysokiej dokładności HiFi, z kolei technologia nanoporowa (ONT) umożliwia generowanie bardzo długich odczytów, obejmujących kompletne transkrypty w pojedynczym przebiegu.
4. Analiza bioinformatyczna: Wyniki sekwencjonowania są analizowane, co pozwala na identyfikację genów, poziomów ich ekspresji, a także wykrywanie nowych transkryptów, izoform lub mutacji.

Zastosowania Full-length Transcriptome Seq.

Analiza pełnej długości transkryptów znajduje zastosowanie w wielu obszarach biologii i genomiki:

• identyfikacja nowych genów i transkryptów,
• charakterystyka alternatywnego splicingu (Alternative Splicing, AS),
• analiza alternatywnych miejsc poliadenylacji (Alternative Polyadenylation, APA),
• identyfikacja długich niekodujących RNA (lncRNA),
• badania regulacji ekspresji genów,
• adnotacja genomów nowych organizmów,
• analiza różnic ekspresji pomiędzy grupami eksperymentalnymi,
• badania mechanizmów rozwojowych i adaptacyjnych,
• identyfikacja biomarkerów molekularnych.

Charakterystyka techniczna full-length Transcriptome Seq.

• Tryb sekwencjonowania: długie odczyty
• Przygotowywanie bibliotek: PolyA enriched celem wyłapania transkryptów mRNA.
• Sekwenatory: platforma Pac-Bio (Revio oraz PacBio sequel Ⅱ); ONT (Nanopore PromethION 48)
• Rekomendowane ilość danych na próbkę Pac-Bio:
  • 1 M HiFi reads
  • 5 M HiFi reads
  • 10 M HiFi reads
  • Dostępne są również inne konfiguracje w zależności od potrzeb klienta.
• Rekomendowane ilość danych na próbkę ONT:
  • 6Gb
  • 12Gb
• Jakość danych:
  • Pac-Bio: 99,8 – 99,99%
  • ONT: Full-length ratio＞70%
• Rekomendowane wymagania dotyczące próbek:
  • Typ próbki: total RNA
  • Ilość: > 1.0 μg
  • Koncentracja (NanoDrop): >100 ng/μL
  • Objętość: >15 μL
  • Czystość:
    • D260/280=1.7-2.5
    • OD260/230=0.5-2.5
    • Niewielkie lub bez kontaminacji białkami lub DNA na żelu
  • RIN (Pac-Bio)
    • For plants: RIN ≥ 7.5;
    • For animals: RIN ≥ 8.0;
    • 5.0 ≥ 28S/18S ≥ 1.0;
  • RIN (ONT):
    • For plants: RIN ≥ 7.0;
    • For animals: RIN ≥ 7.5;
    • 5.0 ≥ 28S/18S ≥ 1.0;
• Możliwa jest również izolacja RNA z dostarczonych próbek. Szczegóły tutaj.

Analiza bioinformatyczna

Kompleksowa analiza bioinformatyczna Full-length Transcriptome Sequencing obejmuje zarówno charakterystykę strukturalną transkryptów, jak i analizę funkcjonalną oraz ilościową.

• Ocena pełnej długości transkryptów i usuwanie redundancji

• Full-length Transcript Assessment: Na tym etapie identyfikowane są pełne transkrypty zawierające:
  • kompletne regiony 5′ UTR,
  • CDS,
  • regiony 3′ UTR,
  • sygnały poliadenylacji.

Transcript Deredundance: Powtarzające się transkrypty są grupowane i konsolidowane, co pozwala uzyskać zestaw unikalnych izoform wykorzystywanych w dalszych analizach.

• Identyfikacja lncRNA i analiza genów docelowych obejmująca:
  • identyfikację kandydatów lncRNA,
  • klasyfikację lncRNA,
  • predykcję genów docelowych,
  • analizę potencjalnych mechanizmów regulacyjnych.
• Analiza elementów funkcjonalnych transkryptów:
  • SSR (Simple Sequence Repeats)
  • CDS (Coding Sequence)
  • TF (Transcription Factors)
  • AS (Alternative Splicing)
  • APA (Alternative Polyadenylation)
• Analiza ekspresji genów
• Adnotacja funkcjonalna i analiza wzbogacenia