Sekwencjonowanie pełnej długości transkryptów (Full-length Transcriptome Sequencing) to nowoczesna metoda analizy transkryptomu wykorzystująca technologie długich odczytów (long-read sequencing), umożliwiająca bezpośrednie odczytanie kompletnych cząsteczek mRNA od końca 5' do 3'. W przeciwieństwie do klasycznego RNA-Seq opartego na krótkich odczytach, technologia Full-length Transcriptome Sequencing pozwala na identyfikację pełnych izoform transkryptów bez konieczności ich rekonstrukcji metodami bioinformatycznymi.
Dzięki zastosowaniu platform Pacific Biosciences (PacBio) oraz Oxford Nanopore Technologies (ONT), możliwe jest precyzyjne wykrywanie alternatywnego splicingu, alternatywnych miejsc poliadenylacji, nowych genów, długich niekodujących RNA (lncRNA) oraz innych złożonych elementów regulacji ekspresji genów.
Technologia ta znajduje zastosowanie zarówno w badaniach podstawowych, jak i projektach translacyjnych, genomice funkcjonalnej, biologii rozwoju, biologii roślin, mikrobiologii oraz medycynie.
Przebieg procesu Full-length Transcriptome Seq
Zastosowanie Full-length Transcriptome Seq
Analiza pełnej długości transkryptów znajduje zastosowanie w wielu obszarach biologii i genomiki:
Charakterystyka techniczna Full-length Transcriptome Seq
- Tryb sekwencjonowania: długie odczyty
- Przygotowywanie bibliotek: PolyA enriched celem wyłapania transkryptów mRNA.
- Sekwenatory: platforma PacBio (Revio oraz PacBio sequel Ⅱ); ONT (Nanopore PromethION 48)
- Rekomendowane ilość danych na próbkę PacBio:
- 1 M HiFi reads
- 5 M HiFi reads
- 10 M HiFi reads
- Dostępne są również inne konfiguracje w zależności od potrzeb klienta.
- Rekomendowane ilość danych na próbkę ONT:
- 6Gb
- 12Gb
- Jakość danych:
- PacBio: 99,8 - 99,99%
- ONT: Full-length ratio＞70%
- Rekomendowane wymagania dotyczące próbek:
- Typ próbki: total RNA
- Ilość: > 1.0 μg
- Koncentracja (NanoDrop): >100 ng/μL
- Objętość: >15 μL
- Czystość:
- D260/280=1.7-2.5
- OD260/230=0.5-2.5
- Niewielkie lub bez kontaminacji białkami lub DNA na żelu
- RIN (PacBio)
- For plants: RIN ≥ 7.5;
- For animals: RIN ≥ 8.0;
- 5.0 ≥ 28S/18S ≥ 1.0;
- RIN (ONT):
- For plants: RIN ≥ 7.0;
- For animals: RIN ≥ 7.5;
- 5.0 ≥ 28S/18S ≥ 1.0;
- Możliwa jest również izolacja RNA z dostarczonych próbek. Szczegóły tutaj.
Analiza bioinformatyczna Full-length Transcriptome Seq
Kompleksowa analiza bioinformatyczna Full-length Transcriptome Sequencing obejmuje zarówno charakterystykę strukturalną transkryptów, jak i analizę funkcjonalną oraz ilościową.
- Ocena pełnej długości transkryptów i usuwanie redundancji
- Full-length Transcript Assessment: Na tym etapie identyfikowane są pełne transkrypty zawierające:
- kompletne regiony 5' UTR,
- CDS,
- regiony 3' UTR,
- sygnały poliadenylacji.
Transcript Deredundance: Powtarzające się transkrypty są grupowane i konsolidowane, co pozwala uzyskać zestaw unikalnych izoform wykorzystywanych w dalszych analizach.
- Identyfikacja lncRNA i analiza genów docelowych obejmująca:
- identyfikację kandydatów lncRNA,
- klasyfikację lncRNA,
- predykcję genów docelowych,
- analizę potencjalnych mechanizmów regulacyjnych.
- Analiza elementów funkcjonalnych transkryptów:
- SSR (Simple Sequence Repeats)
- CDS (Coding Sequence)
- TF (Transcription Factors)
- AS (Alternative Splicing)
- APA (Alternative Polyadenylation)
- Analiza ekspresji genów
- Adnotacja funkcjonalna i analiza wzbogacenia
Wybrane realizacje i publikacje naszych klientów
Sprawdź, dla jakich instytucji wykonujemy sekwencjonowanie NGS i w jakich publikacjach wykorzystano dostarczone przez nas dane.