SLAF-seq

SLAF-seq (Specific-Locus Amplified Fragment Sequencing) to wysokoprzepustowa metoda genotypowania oparta na technologii sekwencjonowania nowej generacji (NGS), należąca do grupy technik Reduced Representation Genome Sequencing (RRGS). Metoda została opracowana jako ekonomiczna alternatywa dla sekwencjonowania całogenomowego (WGS) w projektach wymagających identyfikacji dużej liczby markerów genetycznych przy zachowaniu wysokiej przepustowości i kontroli kosztów.

Podstawą technologii SLAF-seq jest selektywne pozyskiwanie określonych fragmentów genomu poprzez trawienie DNA odpowiednio dobranymi enzymami restrykcyjnymi. Uzyskane fragmenty tworzą tzw. Reduced Representation Library (RRL), czyli reprezentatywną bibliotekę wybranych regionów genomu, która następnie poddawana jest sekwencjonowaniu wysokoprzepustowemu.

W przeciwieństwie do klasycznych metod markerowych, takich jak SSR czy AFLP, SLAF-seq umożliwia jednoczesne odkrywanie i genotypowanie setek tysięcy markerów SNP w pojedynczym eksperymencie. Technologia może być stosowana zarówno dla organizmów posiadających referencyjny genom, jak i dla gatunków bez dostępnej sekwencji referencyjnej.

Przebieg Procesu SLAF-seq

1. Kontrola jakości próbek dostarczonych przez klienta (Sample QC). Uzyskanie wysokiej jakości DNA jest kluczowe dla równomiernego tworzenia bibliotek i wiarygodnego genotypowania, dlatego analizowana jest:
   • integralność DNA,
   • stężenie próbki,
   • czystość materiału genetycznego,
   • obecność potencjalnych inhibitorów reakcji enzymatycznych.
2. Opracowanie projektu eksperymentu (Experimental Design). Właściwie zaprojektowany eksperyment pozwala uzyskać równomierne pokrycie genomu i maksymalną liczbę użytecznych markerów, dlatego na podstawie informacji o badanym gatunku przeprowadzana jest analiza in silico genomu lub danych pokrewnych organizmów. Jej celem jest dobór:
   • odpowiednich enzymów restrykcyjnych,
   • oczekiwanej liczby markerów,
   • zakresu wielkości fragmentów,
   • głębokości sekwencjonowania.

3. Eksperyment pilotażowy (Pilot Experiment). Przed przeprowadzeniem analizy dla wszystkich próbek wykonywany jest testowy eksperyment walidacyjny na trzech losowo wybranych próbkach, obejmujący analizę z trzema różnymi parami enzymów restrykcyjnych. Pozwala on zweryfikować:

• potencjalne problemy związane z genomem badanego organizmu.
• efektywność wybranych enzymów,
• liczbę generowanych fragmentów,
• rozkład wielkości bibliotek,
• potencjalne problemy związane z genomem badanego organizmu.

4. Przygotowanie bibliotek SLAF (SLAF Library Construction)

DNA genomowe jest trawione przy użyciu wybranych enzymów restrykcyjnych. Następnie:

• fragmenty są selekcjonowane pod względem długości,
• ligowane są adaptery sekwencyjne,
• przeprowadzana jest amplifikacja PCR,
• próbki są indeksowane (barcoding),
• biblioteki są przygotowywane do sekwencjonowania.

Każdy wybrany fragment stanowi potencjalny marker genetyczny określany jako SLAF Tag.

5. Sekwencjonowanie wysokoprzepustowe

6. Analiza bioinformatyczna

Zastosowanie SLAF-seq

SLAF-seq znajduje szerokie zastosowanie w genetyce, genomice oraz biologii populacyjnej.

• Mapowanie genetyczne. Metoda umożliwia tworzenie wysokiej gęstości map genetycznych wykorzystywanych do:
  • lokalizacji genów,
  • identyfikacji regionów QTL,
  • badań dziedziczenia cech.
• Analizy asocjacyjne (GWAS). Duża liczba markerów SNP pozwala prowadzić badania związku pomiędzy zmiennością genetyczną a cechami fenotypowymi.
  • lokalizacji genów,
  • identyfikacji regionów QTL,
  • badań dziedziczenia cech.
• Genomika populacyjna, w tym do:
  • oceny różnorodności genetycznej,
  • analizy struktury populacji,
  • badania przepływu genów,
  • identyfikacji zdarzeń ewolucyjnych.

• Selekcja wspomagana markerami (MAS). W programach hodowlanych technologia wspiera:
  • identyfikację korzystnych alleli,
  • przyspieszenie selekcji,
  • poprawę efektywności hodowli.
• Badania filogenetyczne. Duża liczba markerów genomowych umożliwia rekonstrukcję relacji ewolucyjnych pomiędzy gatunkami oraz populacjami.

Charakterystyka techniczna usługi SLAF-seq

• Platforma sekwencjonowania: Illumina
• Eksperyment testowy – dla każdego projektu (3 próbki testowe, każda analizowana z 3 różnymi parami enzymów restrykcyjnych)
• Ilość danych na próbkę (output):
  • 100k tags na próbkę – standardowe, rekomendowane podejście dla organizmów o genomie < 500 Mb
  • 200k tags na próbkę (wielkość genomu badanego organizmu 1 Gb-2 Gb);
  • 300k tags na próbkę (dla dużych i skomplikowanych genomów);
  • 400k tags na próbkę (dla dużych i skomplikowanych genomów);
  • Inna / Niestandardowa (na specjalne życzenie klienta).
• Rekomendowane wymagania dotyczące próbek:
  • Typ próbki: gDNA
  • Ilość: > 80ng
  • Koncentracja (NanoDrop): >10 ng/μL
  • Objętość: >20 μL (minimum 15μL)
  • Czystość (OD260/280): 1.6 – 2.5
• Możliwa analiza GWAS dla projektów obejmujących analizę ponad 200 osobników

Analiza bioinformatyczna SLAF-seq

Po zakończeniu sekwencjonowania dane przechodzą wieloetapową analizę bioinformatyczną, wliczoną w cenę pakietu, która obejmuje: