ATAC-seq

ATAC-seq (Assay for Transposase-Accessible Chromatin Sequencing) to nowoczesna metoda epigenomiczna umożliwiająca identyfikację regionów otwartej chromatyny w skali całego genomu. Technika wykorzystuje hiperaktywną transpozazę Tn5, która jednocześnie tnie DNA i dołącza adaptery sekwencyjne do dostępnych regionów chromatyny. Dzięki temu możliwe jest mapowanie elementów regulatorowych genomu, takich jak promotory, enhancery czy miejsca wiązania czynników transkrypcyjnych.

Przebieg procesu

1. Izolacja komórek lub jąder komórkowych: Analiza rozpoczyna się od przygotowania wysokiej jakości materiału biologicznego. W zależności od rodzaju próbki możliwe jest wykorzystanie całych komórek lub wyizolowanych jąder komórkowych.
2. Tagmentacja chromatyny: Kluczowym etapem metody jest reakcja tagmentacji. Hiperaktywna transpozaza Tn5 rozpoznaje regiony otwartej chromatyny, w których DNA nie jest szczelnie związane z nukleosomami. Proces ten pozwala selektywnie wzbogacić bibliotekę o fragmenty pochodzące z regionów regulatorowych genomu. Enzym jednocześnie:
   • przecina DNA,
   • wprowadza adaptery sekwencyjne,
   • przygotowuje materiał do dalszej amplifikacji.
3. Tworzenie bibliotek: Otrzymane fragmenty DNA poddawane są amplifikacji metodą PCR. Na tym etapie zwiększa się ilość materiału niezbędnego do sekwencjonowania oraz dodaje się indeksy umożliwiające analizę wielu próbek w jednym przebiegu sekwencjonowania.
4. Kontrola jakości bibliotek: Przed sekwencjonowaniem oceniana jest ich jakość. Charakterystycznym wskaźnikiem poprawnie przeprowadzonego eksperymentu jest obecność rozkładu fragmentów odpowiadających regionom wolnym od nukleosomów oraz fragmentów związanych z mono- i dinukleosomami.
5. Sekwencjonowanie: Biblioteki są sekwencjonowane przy wysokiej głębokości pokrycia, co pozwala na precyzyjne określenie poziomu metylacji w milionach pozycji genomowych.
6. Analiza bioinformatyczna: Biblioteki są najczęściej sekwencjonowane w układzie paired-end, co umożliwia dokładniejsze określenie długości fragmentów oraz analizę organizacji nukleosomów. Uzyskane odczyty reprezentują regiony dostępnej chromatyny w genomie.

Zastosowanie ATAC-seq

ATAC-seq dostarcza informacji o krajobrazie regulacyjnym genomu i jest wykorzystywany w wielu obszarach badań biologicznych i biomedycznych.

• Identyfikacja regionów otwartej chromatyny – podstawowym zastosowaniem metody jest wykrywanie aktywnych regionów regulatorowych, które mogą uczestniczyć w kontroli ekspresji genów.
• Analiza miejsc wiązania czynników transkrypcyjnych – dane ATAC-seq umożliwiają identyfikację potencjalnych miejsc wiązania czynników transkrypcyjnych poprzez analizę tzw. footprintingu.
• Mapowanie enhancerów i promotorów – ATAC-seq pozwala wykrywać nowe elementy regulatorowe genomu oraz określać ich aktywność w różnych typach komórek.
• Badania nowotworów – technika jest szeroko stosowana do identyfikacji zmian epigenetycznych związanych z transformacją nowotworową, progresją choroby oraz odpowiedzią na leczenie.
• Badania rozwojowe i komórki macierzyste – ATAC-seq umożliwia śledzenie dynamicznych zmian dostępności chromatyny podczas różnicowania komórek i rozwoju organizmów.
• Badania immunologiczne – metoda pozwala analizować aktywację limfocytów, odpowiedź immunologiczną oraz mechanizmy regulacji genów zaangażowanych w funkcjonowanie układu odpornościowego.

Charakterystyka techniczna ATAC-seq

• Tryb sekwencjonowania: 2x150bp
• Sekwenatory: platforma Illumina, sekwenatory NovaSeq 6000 oraz NovaSeq X.
• Rekomendowana ilość danych na próbkę:
  • 50 M reads na próbkę – minimum 3 powtórzenia biologiczne i dostępny, wysokiej jakości genom referencyjny
• Dostępne są również inne konfiguracje w zależności od potrzeb klienta.

• Rekomendowane wymagania dotyczące próbek:
  • Typ próbki:
    • Komórki / jądra: > 5×10⁵
    • Tkanki: > 100 mg
    • Krew: > 2 mL

Analiza bioinformatyczna ATAC-seq

Analiza danych ATAC-seq obejmuje szereg etapów umożliwiających identyfikację regionów otwartej chromatyny, określenie ich funkcji biologicznej oraz porównanie zmian dostępności chromatyny pomiędzy badanymi grupami.

• Analiza pojedynczej próbki (Intra-sample Analysis)
  • Kontrola jakości danych (Quality Control) – Analizowana jest jakość surowych odczytów, poziom duplikacji, zawartość adapterów oraz skuteczność mapowania do genomu referencyjnego.
  • Mapowanie odczytów do genomu referencyjnego – Odczyty są wyrównywane do genomu referencyjnego, co pozwala określić ich lokalizację oraz ocenić rozkład sygnału ATAC-seq w genomie.
  • Identyfikacja regionów otwartej chromatyny (Peak Calling) – Na podstawie zagęszczenia odczytów identyfikowane są tzw. peaki, odpowiadające regionom dostępnej chromatyny, takim jak promotory, enhancery czy inne elementy regulatorowe.
  • Adnotacja peaków – Wykryte peaki przypisywane są do elementów funkcjonalnych genomu, takich jak promotory, eksony, introny, regiony międzygenowe czy enhancery.
  • Analiza motywów sekwencyjnych i predykcja czynników transkrypcyjnych – Analiza wzbogacenia motywów DNA umożliwia identyfikację potencjalnych czynników transkrypcyjnych odpowiedzialnych za regulację ekspresji genów w badanych komórkach.
  • Analiza funkcjonalna genów związanych z peakami: Geny zlokalizowane w pobliżu regionów otwartej chromatyny poddawane są analizie funkcjonalnej, obejmującej:
    • analizę Ontologii Genów (GO),
    • analizę szlaków biologicznych KEGG,
    • analizę wzbogacenia funkcjonalnego.

• Analiza porównawcza pomiędzy grupami (Inter-group Analysis) – W przypadku badań obejmujących różne warunki eksperymentalne lub grupy biologiczne wykonywana jest analiza różnicowa.
  • Analiza korelacji próbek – Oceniana jest zgodność biologiczna i techniczna pomiędzy próbkami poprzez analizę korelacji oraz grupowanie próbek metodami statystycznymi.
  • Identyfikacja różnicowo dostępnych regionów chromatyny – Porównanie grup umożliwia wykrycie regionów o istotnie zwiększonej lub zmniejszonej dostępności chromatyny (Differentially Accessible Regions, DARs).
  • Analiza motywów w różnicowych peakach – Dla regionów wykazujących istotne zmiany dostępności wykonywana jest analiza motywów regulatorowych, pozwalająca wskazać potencjalne czynniki transkrypcyjne odpowiedzialne za obserwowane różnice.
  • Analiza funkcjonalna genów związanych z różnicowymi peakami – Geny powiązane z różnicowo dostępnymi regionami chromatyny poddawane są analizie GO i KEGG oraz analizie wzbogacenia funkcjonalnego, co umożliwia identyfikację procesów biologicznych i szlaków molekularnych związanych z badanym zjawiskiem.