ATAC-seq (Assay for Transposase-Accessible Chromatin Sequencing) to nowoczesna metoda epigenomiczna umożliwiająca identyfikację regionów otwartej chromatyny w skali całego genomu. Technika wykorzystuje hiperaktywną transpozazę Tn5, która jednocześnie tnie DNA i dołącza adaptery sekwencyjne do dostępnych regionów chromatyny. Dzięki temu możliwe jest mapowanie elementów regulatorowych genomu, takich jak promotory, enhancery czy miejsca wiązania czynników transkrypcyjnych.
Przebieg procesu ATAC-seq
01Izolacja komórek lub jąder komórkowych: Analiza rozpoczyna się od przygotowania wysokiej jakości materiału biologicznego. W zależności od rodzaju próbki możliwe jest wykorzystanie całych komórek lub wyizolowanych jąder komórkowych.
02Tagmentacja chromatyny: Kluczowym etapem metody jest reakcja tagmentacji. Hiperaktywna transpozaza Tn5 rozpoznaje regiony otwartej chromatyny, w których DNA nie jest szczelnie związane z nukleosomami. Proces ten pozwala selektywnie wzbogacić bibliotekę o fragmenty pochodzące z regionów regulatorowych genomu. Enzym jednocześnie:
- przecina DNA,
- wprowadza adaptery sekwencyjne,
- przygotowuje materiał do dalszej amplifikacji.
03Tworzenie bibliotek: Otrzymane fragmenty DNA poddawane są amplifikacji metodą PCR. Na tym etapie zwiększa się ilość materiału niezbędnego do sekwencjonowania oraz dodaje się indeksy umożliwiające analizę wielu próbek w jednym przebiegu sekwencjonowania.
04Kontrola jakości bibliotek: Przed sekwencjonowaniem oceniana jest jakość przygotowanych bibliotek, w tym ich stężenie oraz rozkład długości fragmentów DNA. Charakterystycznym wskaźnikiem prawidłowo przygotowanej biblioteki ATAC-seq jest obecność fragmentów odpowiadających regionom wolnym od nukleosomów (nucleosome-free regions, NFR), a także fragmentów DNA związanych z jednym lub większą liczbą nukleosomów. Rozkład długości fragmentów może wykazywać charakterystyczną periodyczność, odzwierciedlającą organizację nukleosomów w chromatynie.
05Sekwencjonowanie: Przygotowane biblioteki są sekwencjonowane na platformie Illumina, najczęściej w układzie paired-end (PE150). Sekwencjonowanie obu końców fragmentów DNA umożliwia dokładne mapowanie odczytów do genomu referencyjnego oraz określenie długości fragmentów, co jest istotne dla identyfikacji regionów otwartej chromatyny i analizy organizacji nukleosomów.
06Analiza bioinformatyczna: Uzyskane dane poddawane są kontroli jakości, filtrowaniu oraz mapowaniu do genomu referencyjnego. Następnie identyfikowane są regiony otwartej chromatyny (peak calling), które podlegają adnotacji genomowej i analizie motywów wiązania czynników transkrypcyjnych. W projektach obejmujących różne grupy eksperymentalne wykonywana jest również analiza różnicowej dostępności chromatyny, umożliwiająca wskazanie regionów regulatorowych potencjalnie zaangażowanych w badane procesy biologiczne.
Zastosowanie ATAC-seq
ATAC-seq dostarcza informacji o krajobrazie regulacyjnym genomu i jest wykorzystywany w wielu obszarach badań biologicznych i biomedycznych.
01Identyfikacja regionów otwartej chromatyny - podstawowym zastosowaniem metody jest wykrywanie aktywnych regionów regulatorowych, które mogą uczestniczyć w kontroli ekspresji genów.
02Analiza miejsc wiązania czynników transkrypcyjnych - dane ATAC-seq umożliwiają identyfikację potencjalnych miejsc wiązania czynników transkrypcyjnych poprzez analizę tzw. footprintingu.
03Mapowanie enhancerów i promotorów - ATAC-seq pozwala wykrywać nowe elementy regulatorowe genomu oraz określać ich aktywność w różnych typach komórek.
04Badania nowotworów - technika jest szeroko stosowana do identyfikacji zmian epigenetycznych związanych z transformacją nowotworową, progresją choroby oraz odpowiedzią na leczenie.
05Badania rozwojowe i komórki macierzyste - ATAC-seq umożliwia śledzenie dynamicznych zmian dostępności chromatyny podczas różnicowania komórek i rozwoju organizmów.
06Badania immunologiczne - metoda pozwala analizować aktywację limfocytów, odpowiedź immunologiczną oraz mechanizmy regulacji genów zaangażowanych w funkcjonowanie układu odpornościowego.
Charakterystyka techniczna ATAC-seq
- Tryb sekwencjonowania: 2x150bp
- Sekwenatory: platforma Illumina, sekwenatory NovaSeq 6000 oraz NovaSeq X.
- Rekomendowana ilość danych na próbkę:
- 50 M reads na próbkę - minimum 3 powtórzenia biologiczne i dostępny, wysokiej jakości genom referencyjny
- Dostępne są również inne konfiguracje w zależności od potrzeb klienta.
- Rekomendowane wymagania dotyczące próbek:
- Typ próbki:
- Komórki / jądra: > 5x105
- Tkanki: > 100 mg
- Krew: > 2 mL
- Typ próbki:
Analiza bioinformatyczna ATAC-seq
Analiza danych ATAC-seq obejmuje szereg etapów umożliwiających identyfikację regionów otwartej chromatyny, określenie ich funkcji biologicznej oraz porównanie zmian dostępności chromatyny pomiędzy badanymi grupami.
- Analiza pojedynczej próbki (Intra-sample Analysis)
- Kontrola jakości danych (Quality Control) - Analizowana jest jakość surowych odczytów, poziom duplikacji, zawartość adapterów oraz skuteczność mapowania do genomu referencyjnego.
- Mapowanie odczytów do genomu referencyjnego - Odczyty są wyrównywane do genomu referencyjnego, co pozwala określić ich lokalizację oraz ocenić rozkład sygnału ATAC-seq w genomie.
- Identyfikacja regionów otwartej chromatyny (Peak Calling) - Na podstawie zagęszczenia odczytów identyfikowane są tzw. peaki, odpowiadające regionom dostępnej chromatyny, takim jak promotory, enhancery czy inne elementy regulatorowe.
- Adnotacja peaków - Wykryte peaki przypisywane są do elementów funkcjonalnych genomu, takich jak promotory, eksony, introny, regiony międzygenowe czy enhancery.
- Analiza motywów sekwencyjnych i predykcja czynników transkrypcyjnych - Analiza wzbogacenia motywów DNA umożliwia identyfikację potencjalnych czynników transkrypcyjnych odpowiedzialnych za regulację ekspresji genów w badanych komórkach.
- Analiza funkcjonalna genów związanych z peakami: Geny zlokalizowane w pobliżu regionów otwartej chromatyny poddawane są analizie funkcjonalnej, obejmującej:
- analizę Ontologii Genów (GO),
- analizę szlaków biologicznych KEGG,
- analizę wzbogacenia funkcjonalnego.
ZAKRES ANALIZY BIOINFORMATYCZNEJ4 analizy
Analiza porównawcza pomiędzy grupami (Inter-group Analysis)W przypadku badań obejmujących różne warunki eksperymentalne lub grupy biologiczne wykonywana jest analiza różnicowa.
- Analiza korelacji próbek - Oceniana jest zgodność biologiczna i techniczna pomiędzy próbkami poprzez analizę korelacji oraz grupowanie próbek metodami statystycznymi.
Identyfikacja różnicowo dostępnych regionów chromatynyPorównanie grup umożliwia wykrycie regionów o istotnie zwiększonej lub zmniejszonej dostępności chromatyny (Differentially Accessible Regions, DARs).
Analiza motywów w różnicowych peakachDla regionów wykazujących istotne zmiany dostępności wykonywana jest analiza motywów regulatorowych, pozwalająca wskazać potencjalne czynniki transkrypcyjne odpowiedzialne za obserwowane różnice.
Analiza funkcjonalna genów związanych z różnicowymi peakamiGeny powiązane z różnicowo dostępnymi regionami chromatyny poddawane są analizie GO i KEGG oraz analizie wzbogacenia funkcjonalnego, co umożliwia identyfikację procesów biologicznych i szlaków molekularnych związanych z badanym zjawiskiem.
POWIĄZANE ARTYKUŁY
ChIP-seqSingle cell ATAC-seqEPIGENOMICS & 3D GENOMEWhole Genome Bisulfite Sequencing (WGBS)Hi-C seqPorównanie: Illumina i AVITISŁOWA KLUCZOWE
ATAC-seqdostępność chromatynychromatin accessibilityotwarta chromatynaregulacja genomu
Czy ten artykuł był pomocny?
Twoja odpowiedź pomaga nam poprawiać bazę wiedzy.
Dziękujemy - to nam pomaga.
Dziękujemy. Czego zabrakło?
Jedno zdanie wystarczy - trafi do osoby, która prowadzi ten artykuł.
Dziękujemy za uwagę.