Hi-C seq

Hi-C-seq to zaawansowana technika genomowa umożliwiająca badanie przestrzennej organizacji chromatyny w jądrze komórkowym. Metoda pozwala identyfikować regiony DNA, które znajdują się blisko siebie w przestrzeni, nawet jeśli są oddalone od siebie o tysiące lub miliony par zasad w liniowej sekwencji genomu.

Dzięki Hi-C-seq możliwe jest tworzenie map interakcji chromosomowych oraz badanie wyższych poziomów organizacji genomu, takich jak pętle chromatynowe (chromatin loops), domeny TAD (Topologically Associating Domains) oraz kontakty między chromosomami. Technologia odgrywa kluczową rolę w badaniach regulacji ekspresji genów, biologii rozwoju, nowotworów oraz mechanizmów epigenetycznycznych.

Przebieg procesu

Proces Hi-C-seq obejmuje kilka etapów umożliwiających zachowanie i identyfikację naturalnych kontaktów pomiędzy fragmentami chromatyny.

1. Utrwalenie interakcji chromatyny – Komórki poddawane są utrwaleniu formaldehydem, który stabilizuje naturalne kontakty pomiędzy fragmentami chromatyny znajdującymi się blisko siebie w przestrzeni jądra komórkowego.

2. Trawienie chromatyny – DNA jest następnie cięte przy użyciu enzymów restrykcyjnych w wielu miejscach genomu, co prowadzi do powstania krótszych fragmentów DNA.

3. Ligacja fragmentów pozostających w kontakcie – Po trawieniu fragmenty DNA znajdujące się blisko siebie przestrzennie łączą się (ligują). W rezultacie powstają chimeryczne fragmenty DNA zawierające sekwencje pochodzące z odległych regionów genomu, które w jądrze komórkowym kontaktowały się ze sobą.

4. Przygotowanie bibliotek. Powstałe fragmenty są oczyszczane, amplifikowane oraz wzbogacane o adaptery sekwencyjne niezbędne do sekwencjonowania.

5. Sekwencjonowanie NGS – Biblioteki Hi-C są sekwencjonowane metodą paired-end. Uzyskane odczyty zawierają informacje o parach regionów genomu, które pozostawały ze sobą w kontakcie przestrzennym.

Zastosowanie Hi-C

Hi-C-seq umożliwia badanie organizacji genomu na poziomie niedostępnym dla klasycznych metod sekwencjonowania.

• Analiza organizacji chromosomów – Metoda pozwala określić sposób rozmieszczenia chromosomów w jądrze komórkowym oraz identyfikować kontakty międzychromosomowe.
• Identyfikacja domen TAD – Hi-C umożliwia wykrywanie Topologically Associating Domains (TADs), czyli regionów genomu charakteryzujących się częstymi interakcjami wewnętrznymi.
• Analiza pętli chromatynowych – Technologia pozwala identyfikować pętle chromatynowe łączące promotory genów z odległymi enhancerami, które odgrywają kluczową rolę w regulacji ekspresji genów.
• Badania rozwoju organizmów – Zmiany organizacji przestrzennej genomu są istotnym elementem różnicowania komórek oraz procesów rozwojowych.
• Badania nowotworów – Hi-C umożliwia identyfikację zmian strukturalnych genomu i zaburzeń organizacji chromatyny związanych z transformacją nowotworową.
• Integracja z innymi technologiami omicznymi – Dane Hi-C są często integrowane z wynikami RNA-seq, ATAC-seq, ChIP-seq oraz analiz metylacji DNA w celu kompleksowego poznania mechanizmów regulacji genów.

Charakterystyka techniczna Hi-C seq

• Tryb sekwencjonowania: 2x150bp
• Sekwenatory: platforma Illumina, sekwenatory NovaSeq 6000 oraz NovaSeq X.
• Rekomendowane pokrycie genomu na próbkę:
  • 150x na próbkę – celem analizy pętli chromatynowych
  • 50x na próbkę – celem analizy domen TAD
• Dostępne są również inne konfiguracje w zależności od potrzeb klienta.

• Rekomendowane wymagania dotyczące próbek:
  • Typ próbki:
    • Komórki : > 5×10⁷
    • Zamroźona tkanka: od 1 do 2 g

Analiza bioinformatyczna Hi-C seq

Analiza danych Hi-C umożliwia kompleksową charakterystykę trójwymiarowej organizacji genomu, identyfikację interakcji chromatynowych oraz porównanie zmian architektury genomu pomiędzy badanymi warunkami.

• Kontrola jakości bibliotek Hi-C (Hi-C Library QC) – Pierwszym etapem analizy jest ocena jakości danych oraz poprawności przygotowania bibliotek Hi-C.
  • Ocena rozkładu interakcji Hi-C – Analizowany jest rozkład kontaktów chromosomowych oraz proporcja interakcji wewnątrzchromosomowych (cis) i międzychromosomowych (trans), co pozwala ocenić jakość eksperymentu oraz skuteczność ligacji fragmentów DNA.
  • Analiza współczynnika zaniku interakcji (Interaction Decay Exponent, IDE) – Badana jest zależność częstości kontaktów od odległości genomowej. Parametr ten stanowi istotny wskaźnik jakości danych oraz organizacji chromatyny w analizowanych próbkach.
• Analiza interakcji chromatynowych – Na podstawie zmapowanych odczytów tworzona jest szczegółowa mapa kontaktów przestrzennych genomu.
  • Profilowanie interakcji Hi-C w skali całego genomu. Analizowane są interakcje pozwalające określić ogólną organizację przestrzenną genomu:
    • wewnątrzchromosomowe (cis),
    • międzychromosomowe (trans),
  • Mapy kontaktów Hi-C (Hi-C Heatmaps) – Tworzone są macierze kontaktów przedstawiające częstotliwość interakcji pomiędzy regionami genomu. Wizualizacje te umożliwiają identyfikację struktur chromatynowych na różnych poziomach organizacji.
  • Analiza kompartmentów A/B – Hi-C pozwala identyfikować dwa podstawowe typy domen chromatynowych:
    • Kompartment A – regiony aktywne transkrypcyjnie, bogate w geny i otwartą chromatynę,
    • Kompartment B – regiony mniej aktywne, związane z heterochromatyną..
  • Identyfikacja domen TAD (Topologically Associating Domains) – Wykrywane są domeny genomowe charakteryzujące się częstymi interakcjami wewnętrznymi. TAD-y stanowią podstawowe jednostki organizacji przestrzennej chromatyny.
  • Identyfikacja pętli chromatynowych (Chromatin Loops) – Analiza umożliwia wykrywanie bezpośrednich kontaktów pomiędzy odległymi regionami genomu, takimi jak promotory i enhancery, które uczestniczą w regulacji ekspresji genów.
• Analiza różnicowa struktury 3D chromatyny – Porównanie dwóch lub więcej grup biologicznych umożliwia identyfikację zmian architektury genomu związanych z procesami biologicznymi lub chorobowymi.
  • Różnicowe interakcje chromatynowe – Wykrywane są regiony wykazujące istotne zmiany częstości kontaktów pomiędzy badanymi grupami.
  • Zmiany kompartmentów A/B – Analiza pozwala identyfikować regiony genomu przechodzące pomiędzy aktywnym i nieaktywnym stanem chromatyny.
  • Różnicowa analiza TAD – Możliwe jest wykrywanie zmian granic domen TAD oraz reorganizacji ich struktury.
  • Różnicowa analiza pętli chromatynowych – Identyfikowane są nowe lub utracone interakcje regulatorowe mogące wpływać na ekspresję genów.