Whole Genome Bisulfite Sequencing to najbardziej kompleksowa metoda analizy metylacji DNA, umożliwiająca analizę wzorów metylacji na poziomie pojedynczych nukleotydów w całym genomie. Technologia łączy chemiczną konwersję bisulfidową DNA z sekwencjonowaniem nowej generacji, zapewniając najwyższą rozdzielczość w badaniach epigenetycznych.
Metoda pozwala na identyfikację metylowanych cytozyn zarówno w regionach genowych, jak i międzygenowych, dostarczając pełnego obrazu zmian epigenetycznych zachodzących w badanym materiale biologicznym.
Przebieg procesu WGBS
- Izolacja i kontrola jakości DNA: Proces rozpoczyna się od izolacji wysokiej jakości DNA genomowego z badanego materiału. Oceniane jest integralność, czystość oraz ilość DNA.
- Konwersja bisulfidowa: DNA poddawane jest działaniu bisulfitu sodu, który przekształca niemetylowane cytozyny w uracyl, a metylowane pozostawia bez zmian. Jest to kluczowy etap umożliwiający rozróżnienie miejsc metylowanych i niemetylowanych podczas sekwencjonowania.
- Tworzenie bibliotek: Po konwersji DNA przygotowywana jest biblioteka do sekwencjonowania. Na tym etapie dodawane są adaptery umożliwiające amplifikację i odczyt sekwencji.
- Sekwencjonowanie: Biblioteki są sekwencjonowane przy wysokiej głębokości pokrycia, co pozwala na precyzyjne określenie poziomu metylacji w milionach pozycji genomowych.
- Analiza bioinformatyczna: dane podlegają specjalistycznej analizie obejmującej:
- kontrolę jakości odczytów,
- mapowanie sekwencji do genomu referencyjnego,
- identyfikację metylowanych cytozyn,
- wyznaczanie poziomów metylacji,
- analizę różnicowej metylacji pomiędzy próbkami,
- przygotowanie raportów i wizualizacji wyników.
Zastosowanie WGBS
WGBS znajduje zastosowanie w szerokim zakresie badań podstawowych i aplikacyjnych związanych z epigenetyką.
Badania nowotworowe
- identyfikacja biomarkerów epigenetycznych,
- analiza mechanizmów rozwoju nowotworów,
- badanie heterogeniczności nowotworowej,
- monitorowanie odpowiedzi na terapię.
Medycyna translacyjna i diagnostyka
- odkrywanie markerów diagnostycznych i prognostycznych,
- badania chorób genetycznych i epigenetycznych,
- rozwój medycyny spersonalizowanej.
Badania rozwojowe
- analiza zmian epigenetycznych podczas różnicowania komórek,
- badania embriogenezy,
- ocena procesów starzenia organizmu.
Biologia roślin i zwierząt
- analiza regulacji ekspresji genów,
- badania adaptacji środowiskowej,
- projekty hodowlane i genomika funkcjonalna.
Badania środowiskowe i toksykologiczne
- ocena wpływu czynników środowiskowych na epigenom,
- badania odpowiedzi organizmów na stres środowiskowy,
- analiza skutków ekspozycji na substancje chemiczne.
Charakterystyka techniczna WGBS
- Tryb sekwencjonowania: 2x150bp
- Sekwenatory: platforma Illumina, sekwenatory NovaSeq 6000 oraz NovaSeq X.
- Rekomendowane pokrycie genomu:
- 30x na próbkę – minimum 3 powtórzenia biologiczne i dostępny, wysokiej jakości genom referencyjny
- Dostępne są również inne konfiguracje w zależności od potrzeb klienta.
- Rekomendowane wymagania dotyczące próbek:
- Typ próbki: genomowe DNA
- Ilość: > 100ng
- Koncentracja (NanoDrop): >2 ng/μL
- Objętość: >20 μL
- Brak degradacji i kontaminacji
- Możliwa jest również izolacja DNA z dostarczonych próbek. Szczegóły tutaj.
Analiza bioinformatyczna WGBS
Analiza bioinformatyczna danych WGBS obejmuje wieloetapowe przetwarzanie i interpretację wyników sekwencjonowania, prowadzące do kompleksowej charakterystyki metylomu badanego organizmu.
1. Kontrola jakości danych (Data Quality Control): Pierwszym etapem jest ocena jakości surowych danych sekwencyjnych. Analizowane są parametry takie jak jakość odczytów, zawartość adapterów, poziom duplikacji oraz skuteczność konwersji bisulfidowej. Na tej podstawie wykonywane jest filtrowanie i oczyszczanie danych przed dalszą analizą.
2. Mapowanie do genomu referencyjnego. Przefiltrowane odczyty są mapowane do odpowiedniego genomu referencyjnego przy użyciu algorytmów dedykowanych dla danych po konwersji bisulfidowej. Raport obejmuje:
- statystyki mapowania odczytów,
- efektywność wyrównania do genomu,
- głębokość sekwencjonowania,
- pokrycie analizowanych pozycji cytozynowych,
- ocenę kompletności danych dla poszczególnych regionów genomu.
3. Identyfikacja metylacji DNA. Na podstawie zmapowanych odczytów identyfikowane są miejsca metylacji DNA z rozdzielczością pojedynczego nukleotydu. Analiza obejmuje:
- identyfikację metylowanych cytozyn (mC),
- określenie poziomu metylacji dla każdego miejsca,
- charakterystykę kontekstów metylacji:
- mCG (CpG),
- mCHG,
- mCHH (gdzie H = A, T lub C),
- analizę rozmieszczenia metylowanych miejsc w genomie,
- identyfikację motywów sekwencyjnych związanych z metylacją.
4. Profilowanie metylacji w skali całego genomu: Kolejny etap obejmuje kompleksową charakterystykę krajobrazu epigenetycznego badanego genomu. W ramach analizy generowane są:
- profile gęstości i rozmieszczenia metylacji w całym genomie,
- poziomy metylacji w regionach funkcjonalnych (promotory, eksony, introny, regiony międzygenowe),
- profile metylacji w regionach upstream i downstream genów,
- analiza metylacji wysp CpG, brzegów wysp (CpG shores) oraz regionów sąsiadujących,
- adnotacja genów związanych z obserwowanymi wzorami metylacji.
5. Analiza różnic pomiędzy grupami. W projektach porównawczych wykonywana jest analiza różnicowej metylacji pomiędzy badanymi grupami lub warunkami eksperymentalnymi. Obejmuje ona:
- identyfikację różnicowo metylowanych regionów (DMR – Differentially Methylated Regions),
- adnotację DMR względem genów i elementów regulatorowych,
- identyfikację genów związanych z różnicową metylacją,
- analizę wzbogacenia funkcjonalnego GO (Gene Ontology),
- analizę szlaków biologicznych KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes),
- interpretację biologiczną zmian epigenetycznych w kontekście badanego procesu lub fenotypu.
Efektem końcowym jest szczegółowy raport zawierający profile metylacji, wyniki analiz statystycznych, identyfikację regionów różnicowej metylacji oraz interpretację funkcjonalną uzyskanych wyników.
Polish 
English