Whole Genome Bisulfite Sequencing (WGBS)

Whole Genome Bisulfite Sequencing to najbardziej kompleksowa metoda analizy metylacji DNA, umożliwiająca analizę wzorów metylacji na poziomie pojedynczych nukleotydów w całym genomie. Technologia łączy chemiczną konwersję bisulfidową DNA z sekwencjonowaniem nowej generacji, zapewniając najwyższą rozdzielczość w badaniach epigenetycznych.

Metoda pozwala na identyfikację metylowanych cytozyn zarówno w regionach genowych, jak i międzygenowych, dostarczając pełnego obrazu zmian epigenetycznych zachodzących w badanym materiale biologicznym.

Przebieg procesu WGBS

Zastosowanie WGBS

WGBS znajduje zastosowanie w szerokim zakresie badań podstawowych i aplikacyjnych związanych z epigenetyką.

Badania nowotworowe

• identyfikacja biomarkerów epigenetycznych,
• analiza mechanizmów rozwoju nowotworów,
• badanie heterogeniczności nowotworowej,
• monitorowanie odpowiedzi na terapię.

Medycyna translacyjna i diagnostyka

• odkrywanie markerów diagnostycznych i prognostycznych,
• badania chorób genetycznych i epigenetycznych,
• rozwój medycyny spersonalizowanej.

Badania rozwojowe

• analiza zmian epigenetycznych podczas różnicowania komórek,
• badania embriogenezy,
• ocena procesów starzenia organizmu.

Biologia roślin i zwierząt

• analiza regulacji ekspresji genów,
• badania adaptacji środowiskowej,
• projekty hodowlane i genomika funkcjonalna.

Badania środowiskowe i toksykologiczne

• ocena wpływu czynników środowiskowych na epigenom,
• badania odpowiedzi organizmów na stres środowiskowy,
• analiza skutków ekspozycji na substancje chemiczne.

Charakterystyka techniczna WGBS

• Tryb sekwencjonowania: 2x150bp
• Sekwenatory: platforma Illumina, sekwenatory NovaSeq 6000 oraz NovaSeq X.
• Rekomendowane pokrycie genomu:
  • 30x na próbkę - minimum 3 powtórzenia biologiczne i dostępny, wysokiej jakości genom referencyjny
  • Dostępne są również inne konfiguracje w zależności od potrzeb klienta.
• Rekomendowane wymagania dotyczące próbek:
  • Typ próbki: genomowe DNA
  • Ilość: > 100ng
  • Koncentracja (NanoDrop): >2 ng/μL
  • Objętość: >20 μL
  • Brak degradacji i kontaminacji
• Możliwa jest również izolacja DNA z dostarczonych próbek. Szczegóły tutaj.

Analiza bioinformatyczna WGBS

Analiza bioinformatyczna danych WGBS obejmuje wieloetapowe przetwarzanie i interpretację wyników sekwencjonowania, prowadzące do kompleksowej charakterystyki metylomu badanego organizmu.

1. 01Kontrola jakości danych (Data Quality Control):Pierwszym etapem jest ocena jakości surowych danych sekwencyjnych. Analizowane są parametry takie jak jakość odczytów, zawartość adapterów, poziom duplikacji oraz skuteczność konwersji bisulfidowej. Na tej podstawie wykonywane jest filtrowanie i oczyszczanie danych przed dalszą analizą.
2. 02Mapowanie do genomu referencyjnego.Przefiltrowane odczyty są mapowane do odpowiedniego genomu referencyjnego przy użyciu algorytmów dedykowanych dla danych po konwersji bisulfidowej. Raport obejmuje:
   • statystyki mapowania odczytów,
   • efektywność wyrównania do genomu,
   • głębokość sekwencjonowania,
   • pokrycie analizowanych pozycji cytozynowych,
   • ocenę kompletności danych dla poszczególnych regionów genomu.
3. 03Identyfikacja metylacji DNA.Na podstawie zmapowanych odczytów identyfikowane są miejsca metylacji DNA z rozdzielczością pojedynczego nukleotydu. Analiza obejmuje:
   • identyfikację metylowanych cytozyn (mC),
   • określenie poziomu metylacji dla każdego miejsca,
   • charakterystykę kontekstów metylacji:
     • mCG (CpG),
     • mCHG,
     • mCHH (gdzie H = A, T lub C),
   • analizę rozmieszczenia metylowanych miejsc w genomie,
   • identyfikację motywów sekwencyjnych związanych z metylacją.
4. 04Profilowanie metylacji w skali całego genomuKolejny etap obejmuje kompleksową charakterystykę krajobrazu epigenetycznego badanego genomu. W ramach analizy generowane są:
   • profile gęstości i rozmieszczenia metylacji w całym genomie,
   • poziomy metylacji w regionach funkcjonalnych (promotory, eksony, introny, regiony międzygenowe),
   • profile metylacji w regionach upstream i downstream genów,
   • analiza metylacji wysp CpG, brzegów wysp (CpG shores) oraz regionów sąsiadujących,
   • adnotacja genów związanych z obserwowanymi wzorami metylacji.
5. 05Analiza różnic pomiędzy grupami.W projektach porównawczych wykonywana jest analiza różnicowej metylacji pomiędzy badanymi grupami lub warunkami eksperymentalnymi. Obejmuje ona:
   • identyfikację różnicowo metylowanych regionów (DMR - Differentially Methylated Regions),
   • adnotację DMR względem genów i elementów regulatorowych,
   • identyfikację genów związanych z różnicową metylacją,
   • analizę wzbogacenia funkcjonalnego GO (Gene Ontology),
   • analizę szlaków biologicznych KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes),
   • interpretację biologiczną zmian epigenetycznych w kontekście badanego procesu lub fenotypu.

Efektem końcowym jest szczegółowy raport zawierający profile metylacji, wyniki analiz statystycznych, identyfikację regionów różnicowej metylacji oraz interpretację funkcjonalną uzyskanych wyników.