Amplicon Sequencing i metagenomika shotgun to dwie podstawowe metody badania mikrobiomu. Obie pozwalają scharakteryzować społeczności mikroorganizmów, ale różnią się zakresem uzyskiwanych informacji, rozdzielczością, wymaganiami dotyczącymi próbek oraz kosztami.
Wybór metody powinien wynikać przede wszystkim z celu badania. Jeśli chcemy porównać skład określonej grupy mikroorganizmów w wielu próbkach, zazwyczaj wystarczające będzie sekwencjonowanie amplikonowe odpowiedniego markera. Jeżeli projekt obejmuje także analizę potencjału funkcjonalnego całej społeczności, lepszym rozwiązaniem będzie metagenomika shotgun.
Na czym polega Amplicon Sequencing?
Amplicon Sequencing jest metodą ukierunkowaną. Polega na amplifikacji wybranego markera taksonomicznego za pomocą PCR, a następnie sekwencjonowaniu otrzymanych produktów.
Rodzaj markera dobiera się do badanej grupy mikroorganizmów:
Amplicon Sequencing dostarcza przede wszystkim informacji o względnym składzie taksonomicznym badanej grupy mikroorganizmów. Nie umożliwia bezpośredniej analizy aktywności genów u badanych mikroorganizmów.
Kiedy wybrać Amplicon Sequencing?
Sekwencjonowanie amplikonowe będzie odpowiednie, gdy:
- celem jest określenie składu bakterii, archeonów, grzybów lub innych wybranych mikroorganizmów,
- chcemy porównać różnorodność mikrobiologiczną pomiędzy próbkami,
- analizujemy dużą liczbę próbek,
- dysponujemy niewielką ilością DNA,
- projekt ma charakter przesiewowy,
- istotne jest ograniczenie kosztów,
- nie jest wymagana bezpośrednia analiza genów i szlaków metabolicznych.
Metoda sprawdza się m.in. w badaniach mikrobiomu gleby, wody, przewodu pokarmowego, materiału roślinnego, żywności oraz próbek klinicznych.
Na czym polega metagenomika shotgun?
W metagenomice shotgun sekwencjonowane jest całkowite DNA obecne w próbce, bez wcześniejszej amplifikacji pojedynczego markera taksonomicznego. Analiza może więc obejmować jednocześnie materiał genetyczny bakterii, archeonów, grzybów, wirusów DNA oraz innych organizmów, o ile ich DNA jest obecne w próbce i zostanie uzyskana odpowiednia głębokość sekwencjonowania.
Metagenomika shotgun umożliwia nie tylko określenie składu taksonomicznego, lecz także identyfikację aktywnych genów i szlaków metabolicznych. Pozwala pośrednio analizować m.in. geny oporności na antybiotyki, czynniki wirulencji oraz potencjalne funkcje metaboliczne mikrobiomu.
Należy jednak pamiętać, że obecność określonego genu wskazuje na potencjał funkcjonalny społeczności, a nie na jego rzeczywistą aktywność. Do badania aktywnie eksprymowanych genów stosowana jest metatranskryptomika.
Kiedy wybrać metagenomikę shotgun?
Metagenomika shotgun będzie właściwym wyborem, gdy:
- chcemy analizować różne grupy mikroorganizmów bez ograniczania badania do jednego markera,
- potrzebna jest możliwie wysoka rozdzielczość taksonomiczna,
- celem jest analiza potencjału funkcjonalnego mikrobiomu,
- chcemy identyfikować geny oporności, wirulencji lub wybrane szlaki metaboliczne,
- planowana jest rekonstrukcja genomów mikroorganizmów, tzw. MAGs,
- chcemy uniknąć ograniczeń wynikających z doboru starterów i amplifikacji PCR.
Metoda wymaga jednak większej ilości danych, bardziej rozbudowanej analizy bioinformatycznej i zazwyczaj wyższego budżetu.
Najważniejsze różnice
| Kryterium | Amplicon Sequencing | Metagenomika shotgun |
|---|---|---|
| Zakres analizy | Wybrana grupa mikroorganizmów | Wszystkie frakcje DNA obecne w próbce |
| Analizowany materiał | Wybrany marker, np. 16S, ITS lub 18S | Całkowite DNA |
| Bakterie i archeony | Marker 16S rRNA | Analizowane razem z pozostałym DNA |
| Grzyby | Marker ITS | Analizowane razem z pozostałym DNA |
| Informacja taksonomiczna | Zależna od markera i analizowanego regionu | Zwykle wyższa rozdzielczość |
| Analiza funkcjonalna | Ograniczona lub predykcyjna | Bezpośrednia identyfikacja genów i potencjalnych funkcji |
| Ukierunkowana amplifikacja PCR | Tak | Nie |
| Zapotrzebowanie na dane | Mniejsze | Większe |
| Analiza bioinformatyczna | Mniej złożona | Bardziej złożona |
| Koszt | Niższy | Wyższy |
| Analiza dużych kohort | Szczególnie korzystna | Możliwa, ale bardziej kosztowna |
O czym należy pamiętać przed wyborem metody?
W przypadku Amplicon Sequencing wynik zależy od wybranego markera, regionu amplifikacji, zastosowanych starterów oraz jakości baz referencyjnych. Amplifikacja PCR może preferencyjnie namnażać wybrane grupy mikroorganizmów, wpływając na obserwowany profil społeczności.
Jeśli projekt obejmuje jednoczesną analizę bakterii i grzybów, konieczne jest przygotowanie oddzielnych bibliotek dla markerów 16S rRNA i ITS. Nie są one analizowane w ramach jednej reakcji amplifikacji.
W metagenomice shotgun szczególne znaczenie ma natomiast udział DNA gospodarza. W próbkach ludzkich, zwierzęcych lub roślinnych może ono stanowić znaczną część wszystkich odczytów, ograniczając ilość danych przypadających na mikroorganizmy. Może to wymagać zwiększenia głębokości sekwencjonowania lub zastosowania metod redukcji DNA gospodarza.
W obu podejściach uzyskiwane wyniki mają najczęściej charakter względny. Jeśli celem jest określenie bezwzględnej liczebności mikroorganizmów, projekt warto uzupełnić o standardy ilościowe lub metody takie jak qPCR.
Którą metodę wybrać?
Wybierz Amplicon Sequencing, jeśli chcesz ekonomicznie porównać skład określonej grupy mikroorganizmów w dużej liczbie próbek. Do analizy bakterii i archeonów wybierz marker 16S rRNA, natomiast do badania grzybów - region ITS.
Wybierz metagenomikę shotgun, jeśli potrzebujesz szerokiej charakterystyki mikrobiomu bez ograniczania analizy do jednego markera oraz informacji o genach i potencjale funkcjonalnym całej społeczności.
Dobór właściwej metody zależy również od rodzaju materiału, liczby próbek, spodziewanego udziału DNA gospodarza, wymaganej rozdzielczości oraz dostępnego budżetu. Przekaż nam informacje o próbkach i celu badania, a pomożemy dobrać odpowiedni marker, technologię sekwencjonowania, ilość danych oraz zakres analizy bioinformatycznej.
Wybrane realizacje i publikacje naszych klientów
Sprawdź, dla jakich instytucji wykonujemy sekwencjonowanie NGS i w jakich publikacjach wykorzystano dostarczone przez nas dane.