Illumina jest najczęściej wybierana do projektów wymagających dużej liczby bardzo dokładnych krótkich odczytów, takich jak resekwencjonowanie genomu, RNA-seq czy identyfikacja wariantów SNP. PacBio sprawdza się, gdy potrzebne są dokładne długie odczyty HiFi, natomiast Oxford Nanopore Technologies - ONT jest szczególnie przydatny do uzyskiwania bardzo długich i ultra-długich odczytów, analizy modyfikacji DNA oraz bezpośredniego sekwencjonowania RNA.
Nie zawsze trzeba wybierać tylko jedną platformę. W składaniu genomów de novo często najlepsze wyniki zapewnia połączenie długich odczytów PacBio lub ONT z krótkimi odczytami Illumina i danymi Hi-C.
Porównanie technologii
| Kryterium | Illumina | PacBio HiFi | Oxford Nanopore - ONT |
|---|---|---|---|
| Typ odczytów | Krótkie | Długie, wysokiej dokładności | Długie i ultra-długie |
| Typowa długość odczytu | Najczęściej 2 × 150 bp | Zwykle kilkanaście-kilkadziesiąt kb | Od kilku kb do ponad 100 kb dla bibliotek ultra-long |
| Dokładność pojedynczego odczytu | Bardzo wysoka | Bardzo wysoka - HiFi | Wysoka, zależna od chemii, jakości DNA i basecallingu |
| Przepustowość | Bardzo wysoka | Wysoka | Skalowalna zależnie od urządzenia i flow cell |
| SNP i małe InDel | Bardzo dobre zastosowanie | Bardzo dobre zastosowanie | Możliwe, zwykle przy odpowiednim pokryciu i pipeline |
| Warianty strukturalne | Ograniczone możliwości | Bardzo dobre zastosowanie | Bardzo dobre zastosowanie |
| Regiony powtarzalne | Trudniejsze do rozwiązania | Bardzo dobre zastosowanie | Szczególnie dobre dzięki bardzo długim odczytom |
| Haplotypowanie | Ograniczone krótką długością odczytu | Tak | Tak |
| Składanie genomu de novo | Zwykle niewystarczające jako jedyne dane | Tak | Tak |
| Analiza metylacji DNA | Wymaga dodatkowego protokołu, np. WGBS | Możliwa z natywnego DNA | Możliwa z natywnego DNA |
| Pełnej długości transkrypty | Nie w jednym odczycie | Tak - Iso-Seq | Tak - cDNA lub direct RNA |
| Bezpośrednie sekwencjonowanie RNA | Nie | Nie w standardowym workflow | Tak |
| Analiza w czasie rzeczywistym | Nie | Nie | Tak |
| Najważniejsza zaleta | Dokładność, przepustowość i koszt jednostkowy | Połączenie długości i dokładności | Najdłuższe odczyty i elastyczność |
Kiedy wybrać Illumina?
Wybierz Illumina, jeśli:
- planujesz resekwencjonowanie genomu względem dobrej jakości referencji,
- głównym celem jest identyfikacja SNP i małych InDel,
- analizujesz ekspresję genów metodą mRNA-seq lub Total RNA-seq,
- wykonujesz WES, WGBS, ChIP-seq albo ATAC-seq,
- analizujesz dużą liczbę próbek,
- potrzebujesz wysokiej przepustowości i niskiego kosztu pojedynczej zasady,
- wykonujesz Amplicon Sequencing lub metagenomikę shotgun,
- nie potrzebujesz odczytów obejmujących długie regiony powtarzalne.
Illumina wykorzystuje technologię sequencing by synthesis. Najczęściej generowane są odczyty paired-end o długości 2 × 150 bp. Krótkie odczyty mają wysoką jakość, ale mogą być niewystarczające do jednoznacznego złożenia regionów powtarzalnych, rozpoznania złożonych wariantów strukturalnych lub rozdzielenia haplotypów.
Kiedy wybrać PacBio HiFi?
Wybierz PacBio, jeśli:
- celem jest składanie genomu de novo,
- potrzebujesz dokładnych długich odczytów,
- analizujesz złożone warianty strukturalne,
- chcesz rozdzielić haplotypy,
- badany genom jest poliploidalny, heterozygotyczny lub bogaty w sekwencje powtarzalne,
- planujesz analizę pełnej długości transkryptów metodą Iso-Seq,
- zależy Ci na jednoczesnej analizie sekwencji i modyfikacji DNA,
- potrzebujesz wysokiej dokładności konsensusowej bez korekcji krótkimi odczytami.
Technologia PacBio HiFi opiera się na wielokrotnym odczytywaniu tej samej kolistej cząsteczki. Na tej podstawie tworzona jest sekwencja konsensusowa łącząca długość odczytu z bardzo wysoką dokładnością.
PacBio jest szczególnie dobrym wyborem do tworzenia wysokiej jakości genomów referencyjnych i analizy wariantów strukturalnych. Do uzyskania genomu chromosomowego dane HiFi można połączyć z Hi-C.
Kiedy wybrać Oxford Nanopore Technologies?
Wybierz ONT, jeśli:
- potrzebujesz bardzo długich lub ultra-długich odczytów,
- celem jest składanie genomu de novo i łączenie odległych regionów,
- analizujesz złożone rearanżacje i warianty strukturalne,
- chcesz prowadzić sekwencjonowanie i analizę danych w czasie rzeczywistym,
- analizujesz metylację bez wcześniejszej konwersji bisulfitowej,
- chcesz sekwencjonować pełnej długości cząsteczki RNA,
- interesuje Cię bezpośrednie sekwencjonowanie RNA.
Długość odczytów ONT zależy przede wszystkim od długości i jakości cząsteczek wejściowych. Technologia może generować odczyty przekraczające 100 kb, a w odpowiednich warunkach również znacznie dłuższe.
ONT pozwala bezpośrednio analizować natywne DNA i RNA. Jest zatem szczególnie interesujący w projektach dotyczących modyfikacji zasad, pełnej długości transkryptów i heterogeniczności cząsteczek RNA.
Wymagania dotyczące próbek
Dokładne wymagania zależą od zastosowania, organizmu, wybranego protokołu oraz oczekiwanej długości odczytów.
Illumina
Najczęściej wymagane jest:
- oczyszczone DNA lub RNA o odpowiedniej ilości i koncentracji,
- brak inhibitorów reakcji enzymatycznych,
- dobra czystość potwierdzona pomiarami OD260/280 i OD260/230,
- właściwa integralność RNA w projektach RNA-seq,
- DNA może zostać pofragmentowane podczas przygotowania biblioteki.
Illumina nie wymaga zachowania bardzo długich cząsteczek DNA, dlatego materiał może być mniej integralny niż w projektach long-read. Stopień degradacji nadal może jednak wpływać na jakość biblioteki i zakres możliwych analiz.
PacBio HiFi
Najczęściej wymagane jest:
- wysokocząsteczkowe DNA - HMW DNA,
- możliwie mała fragmentacja mechaniczna materiału,
- wysoka czystość i brak inhibitorów,
- ilość DNA odpowiednia dla wybranego protokołu i wielkości genomu,
- wiarygodna ocena koncentracji metodą fluorometryczną,
- kontrola długości fragmentów.
Do analizy Iso-Seq wymagane jest RNA dobrej jakości, ponieważ degradacja może uniemożliwić uzyskanie kompletnych transkryptów.
Oxford Nanopore Technologies
Najczęściej wymagane jest:
- wysokocząsteczkowe lub ultra-wysokocząsteczkowe DNA,
- delikatna izolacja ograniczająca ścinanie DNA,
- wysoka czystość próbki,
- brak pozostałości soli, alkoholu, detergentów i innych inhibitorów,
- odpowiednia ilość materiału dla wybranego zestawu i flow cell.
Jeśli celem są odczyty ultra-long, sposób izolacji i obchodzenia się z DNA jest jednym z najważniejszych elementów całego projektu. Intensywne pipetowanie, worteksowanie, wielokrotne zamrażanie lub niewłaściwy transport mogą znacząco skrócić cząsteczki.
W przypadku direct RNA sequencing wymagane jest natywne RNA spełniające wymagania konkretnego protokołu ONT.
Orientacyjna ilość danych
Ilość danych należy dobierać na podstawie wielkości genomu, ploidalności, heterozygotyczności, rodzaju analizy i oczekiwanego pokrycia.
Illumina
Orientacyjne wartości:
- resekwencjonowanie genomu: zwykle około 20-30×,
- analiza ludzkiego WGS: najczęściej około 30×,
- składanie małego genomu mikroorganizmu: często co najmniej 50-100×,
- mRNA-seq: zazwyczaj około 20-30 mln par odczytów na próbkę,
- projekty wymagające analizy słabo eksprymowanych transkryptów lub nowych izoform mogą wymagać większej ilości danych.
PacBio HiFi
Orientacyjne wartości:
- składanie genomu de novo: zazwyczaj około 20-30×,
- genomy heterozygotyczne, poliploidalne lub szczególnie złożone mogą wymagać większego pokrycia,
- analiza wariantów strukturalnych i haplotypowanie: zakres należy dobrać do organizmu i celu projektu,
- Iso-Seq: ilość danych zależy od złożoności transkryptomu i liczby badanych tkanek lub warunków.
Oxford Nanopore Technologies
Orientacyjne wartości:
- składanie genomu de novo: często około 30-40×,
- analiza wariantów strukturalnych: zwykle co najmniej kilkanaście-kilkadziesiąt razy, zależnie od celu,
- dane ultra-long jako uzupełnienie assembly: ilość dobierana indywidualnie,
- direct RNA lub full-length transcriptome: ilość danych zależy od liczby próbek, złożoności transkryptomu i oczekiwanej czułości.
W projektach de novo ilość danych powinna być obliczana w gigabazach na podstawie oszacowanej wielkości genomu:
ilość danych = wielkość genomu × planowane pokrycie
Czy warto łączyć technologie?
Tak. Podejście hybrydowe może dostarczyć pełniejszych informacji niż zastosowanie jednej platformy.
Najczęściej stosowane połączenia to:
Wybór takiego podejścia powinien wynikać z konkretnego celu, a nie z założenia, że większa liczba technologii zawsze poprawia wynik.
Typowe błędy przy wyborze technologii
Wybór platformy przed określeniem celu projektu
Technologia powinna wynikać z pytania badawczego. Inna platforma będzie optymalna do analizy SNP w dużej populacji, a inna do złożenia nowego genomu referencyjnego.
Próba złożenia złożonego genomu wyłącznie z krótkich odczytów
Illumina może nie rozwiązać długich powtórzeń i złożonych regionów genomu. Do assembly de novo dużych genomów eukariotycznych zazwyczaj potrzebne są długie odczyty.
Dostarczenie pofragmentowanego DNA do long-read sequencing
W PacBio i ONT długość uzyskanych odczytów zależy od integralności materiału wejściowego. Uszkodzonego DNA nie można odtworzyć na etapie przygotowania biblioteki.
Kierowanie się wyłącznie liczbą gigabaz
Ta sama ilość danych może mieć inną wartość analityczną zależnie od długości, dokładności i rozkładu odczytów. Należy uwzględnić pokrycie genomu oraz cel analizy.
Założenie, że każdy long-read daje taki sam rezultat
PacBio HiFi i ONT mają różne profile korzyści. PacBio łączy długie odczyty z bardzo wysoką dokładnością, natomiast ONT może dostarczać znacznie dłuższe odczyty i dane w czasie rzeczywistym.
Brak uwzględnienia ploidalności i heterozygotyczności
Wielkość genomu nie jest jedynym parametrem decydującym o wymaganej ilości danych. Genomy poliploidalne, hybrydowe i silnie heterozygotyczne mogą wymagać większego pokrycia oraz odpowiedniej strategii bioinformatycznej.
Założenie, że long-read zastępuje Hi-C
Długie odczyty umożliwiają budowę kontigów, ale dane Hi-C są często potrzebne do uporządkowania i orientacji sekwencji na poziomie chromosomów.
Pytania do planowania projektu
Przed wyborem technologii zastanów się nad następującymi pytaniami:
Zaplanuj projekt
Opisz projekt - dobierzemy metodę i ilość danych.
Na podstawie badanego organizmu, jakości materiału i celu analizy pomożemy wybrać Illumina, PacBio, Oxford Nanopore lub podejście hybrydowe. Określimy również wymagane pokrycie, sposób przygotowania próbek i odpowiedni zakres analizy bioinformatycznej.