ChIP-seq (Chromatin Immunoprecipitation Sequencing), czyli sekwencjonowanie DNA po immunoprecypitacji chromatyny, umożliwia identyfikację regionów genomu związanych z określonymi białkami, w tym czynnikami transkrypcyjnymi, oraz analizę rozmieszczenia modyfikacji histonów. Metoda łączy immunoprecypitację chromatyny (ChIP) z sekwencjonowaniem nowej generacji (NGS).
Uzyskane dane pozwalają określić lokalizację regionów wzbogaconych w DNA związane z badanym białkiem, analizować potencjalne mechanizmy regulacji genów oraz porównywać profile wiązania białek i modyfikacji chromatyny między warunkami doświadczalnymi.
Usługa obejmuje przygotowanie bibliotek z dostarczonego ChIP DNA oraz ich sekwencjonowanie. Oferujemy również możliwość sekwencjonowania gotowych bibliotek ChIP-seq przygotowanych przez klienta.
Przebieg procesu ChIP-seq
W przypadku bibliotek przygotowanych samodzielnie przez klienta etap ten jest pomijany.
Zastosowanie ChIP-seq
Charakterystyka techniczna ChIP-seq
- Platforma: Illumina.
- Tryb sekwencjonowania: standardowo PE150 (2 × 150 bp).
- Alternatywne konfiguracje: sekwencjonowanie single-end, w tym SE50, po potwierdzeniu dostępności i kompatybilności bibliotek.
- Materiał wejściowy: ChIP DNA lub gotowe biblioteki ChIP-seq.
- Przygotowanie bibliotek: z DNA po immunoprecypitacji chromatyny.
- Rekomendowana ilość danych: 10 Gb na próbkę w standardowej konfiguracji PE150, z możliwością dostosowania głębokości sekwencjonowania.
10 Gb odpowiada około 33 mln par odczytów PE150 o pełnej długości. Rzeczywista liczba fragmentów przydatnych do analizy zależy od jakości bibliotek, efektywności mapowania i stopnia duplikacji odczytów.
W przypadku badań rozległych obszarów wzbogacenia, np. wybranych modyfikacji histonów, może być konieczne zwiększenie ilości danych. Parametry dobieramy indywidualnie do charakterystyki projektu.
Wymagania dotyczące próbek
ChIP DNA do przygotowania bibliotek
| Parametr | Rekomendowane wymaganie |
|---|---|
| Typ próbki | Oczyszczone ChIP DNA |
| Ilość całkowita | ≥50 ng preferowane |
| Minimalna ilość | ≥10 ng, po uzgodnieniu |
| Stężenie preferowane | ≥2 ng/µl |
| Objętość | ≥25 µl |
| Długość fragmentów | 100-750 bp |
| Preferowany główny zakres fragmentów | 200-600 bp |
| Czystość A260/A280 | 1,8-2,0 |
| Bufor | Woda wolna od nukleaz, EB lub Low TE |
Kwalifikacja próbek odbywa się na podstawie kontroli jakości. W przypadku mniejszej ilości materiału możliwość przygotowania bibliotek wymaga indywidualnego potwierdzenia.
Gotowe biblioteki ChIP-seq
Oferujemy sekwencjonowanie bibliotek ChIP-seq przygotowanych samodzielnie przez klienta, bez konieczności ponownego wykonywania etapu przygotowania bibliotek.
Biblioteki powinny być kompatybilne z platformą Illumina oraz zawierać adaptery i indeksy umożliwiające prawidłowe sekwencjonowanie i identyfikację próbek.
Przed przyjęciem bibliotek wymagane są informacje dotyczące:
- Zestawu wykorzystanego do przygotowania bibliotek.
- Stężenia, objętości i rozkładu długości fragmentów.
- Sekwencji i rodzaju indeksów (i7/i5).
- Planowanej konfiguracji sekwencjonowania (SE lub PE).
- Docelowej liczby odczytów lub ilości danych na próbkę.
Ostateczne wymagania dotyczące ilości, stężenia i objętości bibliotek ustalane są na podstawie parametrów planowanego sekwencjonowania. Biblioteki podlegają kontroli jakości przed zakwalifikowaniem do sekwencjonowania.
Analiza bioinformatyczna ChIP-seq
Zakres analizy bioinformatycznej ChIP-seq może obejmować:
- Kontrolę jakości danych sekwencyjnych i filtrację odczytów.
- Mapowanie odczytów do genomu referencyjnego.
- Ocenę jakości mapowania, duplikacji i wzbogacenia sygnału.
- Identyfikację regionów wzbogacenia (peak calling).
- Adnotację regionów względem genów i elementów regulatorowych.
- Analizę rozmieszczenia sygnału w pobliżu miejsc startu transkrypcji (TSS).
- Identyfikację wzbogaconych motywów sekwencyjnych (motif analysis).
- Analizę funkcjonalną genów powiązanych z regionami wzbogacenia, w tym GO i KEGG.
- Porównanie regionów wzbogacenia między grupami eksperymentalnymi (differential peak analysis).
W zależności od zakresu projektu wyniki mogą obejmować pliki FASTQ, BAM, BED, bigWig oraz raporty i wizualizacje bioinformatyczne.
Zakres analizy dostosowujemy do badanego organizmu, dostępności genomu referencyjnego, rodzaju białka lub modyfikacji histonu, liczby powtórzeń biologicznych oraz obecności odpowiednich prób kontrolnych.
W projektach obejmujących wyłącznie sekwencjonowanie gotowych bibliotek analiza bioinformatyczna może zostać zamówiona jako dodatkowy element usługi.