Do składania dużych genomów eukariotycznych najlepszym punktem wyjścia jest obecnie PacBio HiFi, które łączy długie odczyty z wysoką dokładnością. Oxford Nanopore warto wybrać, gdy priorytetem są bardzo długie odczyty i rozwiązanie regionów powtarzalnych, natomiast Illumina sprawdza się przede wszystkim w Genome Survey (wstępnej ocenie genomu), kontroli jakości i projektach dotyczących małych, prostych genomów.
Jeżeli celem jest wysokiej jakości genom referencyjny na poziomie chromosomów, najczęściej rekomendowane jest podejście hybrydowe: PacBio HiFi + Hi-C, opcjonalnie uzupełnione o ONT ultra-long i Illumina.
Porównanie technologii
| Technologia | Najważniejsza zaleta | Główne ograniczenie | Najlepsze zastosowanie |
|---|---|---|---|
| Illumina | Bardzo dokładne i tanie krótkie odczyty | Trudności z powtórzeniami i haplotypami | Genome Survey, małe genomy, dodatkowa kontrola |
| PacBio HiFi | Długie i bardzo dokładne odczyty | Wymaga wysokiej jakości HMW DNA | Referencyjne assembly de novo |
| Oxford Nanopore | Bardzo długie i ultra-długie odczyty | Wynik silnie zależy od jakości HMW DNA | Powtórzenia, centromery, telomery, T2T |
| Podejście hybrydowe | Największa kompletność i ciągłość | Wyższy koszt i więcej materiału | Genom na poziomie chromosomów |
Kiedy wybrać Illumina?
Illumina będzie odpowiednia, gdy:
- chcesz wykonać wstępną ocenę genomu - Genome Survey,
- potrzebujesz oszacować wielkość genomu, heterozygotyczność i udział powtórzeń,
- analizujesz niewielki i mało złożony genom bakteryjny,
- dane mają służyć do dodatkowej kontroli lub korekcji assembly,
- dysponujesz DNA, które nie spełnia wymagań long-read sequencing.
Illumina może wystarczyć do draftowego assembly małego genomu. W przypadku dużych genomów roślinnych i zwierzęcych krótkie odczyty zwykle nie pozwalają prawidłowo opisać regionów powtarzalnych, duplikacji i haplotypów.
Kiedy wybrać PacBio HiFi?
PacBio HiFi jest rekomendowane, gdy:
- celem jest wysokiej jakości assembly de novo,
- genom jest duży, heterozygotyczny lub poliploidalny,
- potrzebne jest rozdzielenie haplotypów,
- ważna jest wysoka dokładność na poziomie pojedynczych zasad,
- analizowane będą warianty strukturalne,
- genom zawiera liczne powtórzenia i duplikacje.
PacBio HiFi jest często najlepszą podstawą do budowy nowego genomu referencyjnego (de novo). Aby uporządkować kontigi w chromosomy, dane HiFi należy uzupełnić o Hi-C.
Kiedy wybrać Oxford Nanopore?
ONT warto wybrać, gdy:
- kluczowa jest maksymalna długość odczytów,
- celem jest rozwiązanie bardzo długich powtórzeń,
- analizowane są centromery, telomery lub duplikacje segmentowe,
- projekt zmierza w kierunku assembly telomere-to-telomere,
- ważna jest identyfikacja dużych rearanżacji,
- dostępne jest bardzo dobrej jakości ultra-HMW DNA.
ONT może być stosowany samodzielnie lub jako uzupełnienie PacBio HiFi. Nawet umiarkowane pokrycie odczytami ultra-long może pomóc połączyć regiony, których nie rozwiązały krótsze odczyty.
Kiedy wybrać podejście hybrydowe?
Podejście hybrydowe jest najlepsze, gdy celem jest uzyskanie kompletnego genomu 0-gap.
Najczęstsze kombinacje to:
Współczesne dane PacBio HiFi często nie wymagają dodatkowego polerowania za pomocą Illumina. Krótkie odczyty pozostają jednak przydatne do Genome Survey i niezależnej kontroli assembly.
Wymagania dotyczące próbek
Illumina
- oczyszczone genomowe DNA,
- zwykle co najmniej około 1 µg,
- stężenie od około 30 ng/µl,
- zachowanie ultra-długich fragmentów nie jest wymagane.
PacBio HiFi
- wysokocząsteczkowe DNA - HMW DNA,
- zwykle kilka-kilkanaście mikrogramów, zależnie od protokołu,
- wysoka czystość i integralność,
- minimalna fragmentacja powodowana izolacją i/lub transportem,
- preferowany świeży lub prawidłowo zamrożony materiał.
Oxford Nanopore
- HMW lub ultra-HMW DNA,
- zwykle kilka mikrogramów lub więcej,
- bardzo wysoka czystość,
- zakaz intensywnego pipetowania i worteksowania próbek,
- odpowiednia metoda izolacji dobrana do oczekiwanej długości odczytów.
Dokładne wymagania zależą od wielkości genomu, technologii i liczby planowanych bibliotek. Najlepiej skonsultować sposób pobrania i izolacji jeszcze przed rozpoczęciem eksperymentu.
Orientacyjna ilość danych
| Rodzaj danych | Orientacyjne pokrycie |
|---|---|
| Illumina Genome Survey | około 30-50×, rekomendowane nawet ≥50× |
| PacBio HiFi de novo | około 25-30× |
| PacBio HiFi na haplotyp | około 10-15× na haplotyp |
| ONT long-read | około 30-40× |
| ONT ultra-long jako uzupełnienie | około 5-15× |
| Hi-C | dobierane do wielkości i złożoności genomu |
Ilość danych oblicza się według wzoru:
wielkość genomu × planowane pokrycie = wymagana ilość danych
Przykład: genom o wielkości 1 Gb przy pokryciu 30× wymaga około 30 Gb danych.
Dla genomów poliploidalnych, silnie heterozygotycznych lub bogatych w powtórzenia może być potrzebne większe pokrycie.
Typowe błędy
- wybór sekwencjonowania opartego tylko na Illumina do dużego genomu z dużą ilością sekwencji powtarzalnych,
- rozpoczęcie projektu bez oszacowania wielkości genomu i heterozygotyczności,
- dostarczenie zdegradowanego DNA do PacBio lub ONT,
- intensywne pipetowanie i wielokrotne zamrażanie HMW DNA,
- nieuwzględnienie ploidalności i pochodzenia hybrydowego,
- brak Hi-C przy oczekiwaniu assembly na poziomie chromosomowym,
- sekwencjonowanie DNA pochodzącego z wielu genetycznie różnych osobników.
Jakość genomu należy oceniać również pod względem kompletności, dokładności, liczby luk, obecności kontaminacji i prawidłowego rozdzielenia haplotypów.
Pytania przy planowaniu projektu
Zaplanuj projekt
Masz wątpliwości? Opisz nam swój projekt, a my pomożemy dobrać odpowiednią technologię, ilość danych i próbek.