Metatranscriptomic Seq, czyli sekwencjonowanie metatranskryptomiczne, umożliwia badanie ekspresji genów w złożonych społecznościach mikroorganizmów bez konieczności ich wcześniejszej hodowli. Analiza obejmuje RNA pochodzące m.in. z próbek gleby, wody, kału, treści jelitowej czy wymazów.
Uzyskane dane pozwalają scharakteryzować profil transkrypcyjny społeczności, przypisać transkryptom funkcje biologiczne oraz porównać ekspresję genów między warunkami doświadczalnymi. Metoda znajduje zastosowanie w badaniach aktywności mikrobiomu oraz jego odpowiedzi na zmiany środowiska lub oddziaływanie gospodarza.
Przebieg procesu Metatranscriptomic Seq
Zastosowanie Metatranscriptomic Seq
Charakterystyka techniczna Metatranscriptomic Seq
- Platforma: Illumina.
- Tryb sekwencjonowania: PE150, czyli 2 × 150 bp.
- Przygotowanie bibliotek: biblioteki kierunkowe po deplecji rRNA.
- Rekomendowana ilość danych: 12 Gb na próbkę.
12 Gb odpowiada około 40 mln par odczytów PE150 o pełnej długości. Docelową ilość danych dobieramy do złożoności mikrobiomu, udziału RNA gospodarza i celu badania. Liczba odczytów użytecznych w analizie zależy także od skuteczności usunięcia rRNA oraz filtracji danych.
Wymagania dotyczące próbek
| Parametr | Wymaganie |
|---|---|
| Typ próbki | Całkowite RNA |
| Ilość całkowita | ≥1 µg |
| Stężenie | ≥50 ng/µl |
| Objętość | ≥20 µl |
| Integralność | RIN ≥6,5 |
| Czystość A260/A280 | 1,8-2,0 |
| Czystość A260/A230 | 1,0-2,5 |
Możliwa jest również izolacja RNA z dostarczonego materiału. Rodzaj, ilość i sposób zabezpieczenia próbek do izolacji wymagają wcześniejszego uzgodnienia. Kwalifikacja materiału do przygotowania bibliotek następuje na podstawie kontroli jakości.
Analiza bioinformatyczna Metatranscriptomic Seq
Zakres analizy bioinformatycznej obejmuje:
- Kontrolę jakości danych sekwencyjnych.
- Składanie transkryptów.
- Adnotację taksonomiczną i ocenę względnego udziału transkryptów przypisanych poszczególnym taksonom.
- Analizę różnorodności alfa i beta.
- Adnotację funkcjonalną z wykorzystaniem baz GO, KEGG, eggNOG, CAZy, CARD i PHI.
- Kwantyfikację ekspresji genów oraz analizę różnic między grupami.
Profil taksonomiczny uzyskany z RNA zależy zarówno od udziału mikroorganizmów w próbce, jak i ich ekspresji genów. Zakres analiz i porównań dopasowujemy do celu projektu, dostępnych metadanych oraz liczby powtórzeń biologicznych.
Opisz projekt - dobierzemy metodę i ilość danych.