Panel genowy warto wybrać, gdy analizowana choroba lub cecha jest powiązana z dobrze określoną grupą genów i potrzebna jest wysoka głębokość sekwencjonowania. WES umożliwia szersze poszukiwanie wariantów w regionach kodujących, natomiast WGS zapewnia najbardziej kompleksową analizę genomu, obejmującą również regiony niekodujące i szerszy zakres wariantów strukturalnych.
Wybór metody powinien zależeć od celu projektu, rodzaju materiału, oczekiwanych wariantów, wymaganej czułości oraz możliwości interpretacji danych.
Porównanie metod
| Kryterium | Panel genowy | WES | WGS |
|---|---|---|---|
| Zakres analizy | Wybrane geny lub regiony | Regiony kodujące - eksom | Prawie cały genom |
| Udział analizowanego genomu | Bardzo mały, zależny od panelu | Około 1-2% genomu | Regiony kodujące i niekodujące |
| SNV i małe InDel | Bardzo dobre wykrywanie w regionach panelu | Bardzo dobre wykrywanie w eksomie | Bardzo dobre wykrywanie w całym genomie |
| CNV | Możliwe, zależnie od projektu i walidacji | Możliwe, z ograniczeniami | Zwykle szersze możliwości |
| Warianty strukturalne | Ograniczony zakres | Ograniczony zakres | Najszersze możliwości spośród tych metod |
| Regiony regulatorowe i głębokie introny | Tylko jeśli uwzględniono je w panelu | Zwykle nie | Tak |
| Pokrycie regionów docelowych | Najwyższe | Wysokie, ale zależne od skuteczności wzbogacenia | Niższe przy tej samej liczbie odczytów, ale bardziej równomierne |
| Warianty o niskiej częstości allelu | Dobre wykrywanie przy wysokim pokryciu i UMI | Możliwe przy odpowiedniej głębokości | Wymagają odpowiednio wysokiego pokrycia |
| Ilość danych | Najmniejsza | Pośrednia | Największa |
| Złożoność analizy | Najmniejsza | Pośrednia | Największa |
| Możliwość ponownej analizy | Tylko regiony panelu | Cały eksom | Praktycznie cały genom |
| Koszt | Zwykle najniższy | Pośredni | Najwyższy |
Kiedy wybrać WGS?
Wybierz Whole Genome Sequencing, jeśli:
- potrzebujesz możliwie kompleksowej analizy genomu,
- wcześniejszy panel lub WES nie wyjaśniły badanego fenotypu,
- interesują Cię warianty w regionach niekodujących, regulatorowych lub głębokich intronach,
- chcesz analizować SNV, InDel, CNV i warianty strukturalne na podstawie jednego zestawu danych,
- ważne jest bardziej równomierne pokrycie genomu bez etapu hybrydyzacyjnego wzbogacania,
- projekt ma umożliwiać ponowną analizę danych w przyszłości,
- analizujesz organizm, dla którego WES lub odpowiedni panel nie są dostępne.
WGS nie wymaga selektywnego wychwytywania regionów docelowych. Dzięki temu ogranicza bias związany z hybrydyzacją sond i pozwala analizować regiony, których nie obejmuje WES ani standardowy panel genowy.
Większy zakres nie oznacza jednak, że każdy typ wariantu zostanie wykryty z jednakową skutecznością. Analiza regionów powtarzalnych, niektórych wariantów strukturalnych i ekspansji powtórzeń może wymagać dedykowanych algorytmów, dodatkowej walidacji lub sekwencjonowania długich odczytów.
Kiedy wybrać WES?
Wybierz Whole Exome Sequencing, jeśli:
- podejrzewasz, że przyczyna badanego fenotypu znajduje się w regionie kodującym,
- lista potencjalnych genów jest długa lub nie została jeszcze określona,
- analizujesz chorobę rzadką lub heterogeniczną genetycznie,
- projekt obejmuje układ trio: proband i rodzice,
- chcesz identyfikować nowe geny kandydackie,
- potrzebujesz szerszego zakresu niż panel przy niższym koszcie i mniejszej ilości danych niż w WGS.
WES wykorzystuje sondy hybrydyzacyjne do wychwytywania eksonów oraz wybranych przylegających regionów istotnych dla splicingu. Metoda koncentruje się na około 1-2% ludzkiego genomu, ale obejmuje wiele wariantów bezpośrednio wpływających na strukturę i funkcję białek.
Zakres WES zależy od zastosowanego zestawu do wzbogacania. Nie wszystkie eksony są pokrywane jednakowo, a regiony o wysokiej zawartości GC, pseudogeny i sekwencje homologiczne mogą być trudne do analizy.
Kiedy wybrać panel genowy?
Wybierz panel genowy, jeśli:
- badana choroba lub fenotyp są związane ze znaną grupą genów,
- potrzebujesz wysokiej głębokości pokrycia wybranych regionów,
- celem jest wykrywanie wariantów występujących z niską częstością allelu,
- analizujesz materiał nowotworowy, próbki FFPE lub cfDNA,
- projekt obejmuje dużą liczbę próbek,
- potrzebny jest krótki czas analizy i ograniczona liczba wariantów do interpretacji,
- chcesz zastosować znaczniki UMI w celu ograniczenia wpływu błędów technicznych.
Panel może obejmować od kilku do kilkuset genów. Oprócz eksonów można w nim uwzględnić wybrane regiony regulatorowe, miejsca splicingowe, introny lub hotspoty mutacyjne.
Najważniejszym ograniczeniem panelu jest zamknięty zakres analizy. Wariant znajdujący się poza zaprojektowanymi regionami nie zostanie wykryty, a rozszerzenie badania może wymagać przygotowania nowej biblioteki.
Wymagania dotyczące próbek
Wymagania zależą od sposobu przygotowania biblioteki, rodzaju materiału, oczekiwanej głębokości i zastosowania znaczników UMI.
Standardowy materiał do WGS i WES
Rekomendowane jest:
- oczyszczone genomowe DNA,
- co najmniej 1 µg DNA dla standardowego workflow Illumina,
- stężenie co najmniej 30 ng/µl,
- odpowiednia objętość zgodna z wymaganiami podanymi wraz z ofertą,
- pomiar koncentracji metodą fluorometryczną, np. Qubit,
- OD260/280 najczęściej w zakresie około 1,8-2,0,
- możliwie niski poziom degradacji,
- brak alkoholu, soli, detergentów i innych inhibitorów.
Panel genowy
Wymagana ilość DNA zależy od rodzaju panelu i materiału. Możliwa jest analiza mniejszych ilości DNA, jednak próbki FFPE, biopsje płynne i cfDNA wymagają indywidualnej kwalifikacji.
W takich projektach należy podać:
- rodzaj i sposób utrwalenia materiału,
- ilość i koncentrację DNA,
- stopień degradacji,
- udział komórek nowotworowych,
- spodziewaną częstość allelu wariantowego,
- dostępność próbki prawidłowej - matched normal.
Niska ilość DNA nie zawsze dyskwalifikuje próbkę, ale może ograniczać czułość analizy i zwiększać ryzyko artefaktów.
Orientacyjna ilość danych i pokrycie
Panel genowy
Zakres danych zależy od wielkości panelu i wymaganej czułości. Typowe średnie pokrycie może wynosić:
- około 100-250× w analizach wariantów germinalnych,
- około 500-1000× lub więcej w analizach somatycznych,
- jeszcze większe surowe pokrycie w analizach cfDNA, szczególnie z użyciem UMI.
W przypadku UMI istotne jest nie tylko surowe pokrycie, ale również liczba niezależnych cząsteczek i pokrycie konsensusowe po deduplikacji.
WES
Orientacyjne warianty obejmują:
- około 5 Gb danych na próbkę - odpowiadające orientacyjnie średniemu pokryciu około 50×,
- około 10 Gb na próbkę - często stosowane do uzyskania wyższego pokrycia, np. około 100×,
- większą ilość danych w analizach somatycznych lub przy oczekiwanej niskiej częstości allelu.
Przy ocenie jakości WES należy uwzględniać nie tylko średnie pokrycie, ale także odsetek regionów docelowych osiągających co najmniej 20×, 30× lub inną wartość wymaganą w projekcie.
WGS
Dla ludzkiego genomu najczęściej stosuje się:
- około 90 Gb czystych danych jako wartość teoretycznie odpowiadającą 30× dla genomu o wielkości 3 Gb,
- w praktyce często około 90-120 Gb danych na próbkę, zależnie od sposobu raportowania, jakości odczytów i wymaganego efektywnego pokrycia,
- około 30× w standardowej analizie wariantów germinalnych,
- większe pokrycie w analizach somatycznych, mozaikowych lub wymagających wykrywania wariantów o niskiej częstości allelu.
Ostateczna ilość danych powinna zostać obliczona na podstawie zakresu badania, celu analizy, jakości materiału oraz oczekiwanej czułości.
Typowe błędy przy wyborze metody
Pytania do planowania projektu
Przed wyborem metody ustal:
Zaplanuj projekt
Opisz projekt - dobierzemy metodę i ilość danych.
Na podstawie celu badania, rodzaju materiału, listy genów i oczekiwanej częstości wariantów pomożemy wybrać panel genowy, WES lub WGS. Dobierzemy także sposób przygotowania biblioteki, odpowiednią głębokość sekwencjonowania oraz zakres analizy bioinformatycznej.
Wybrane realizacje i publikacje naszych klientów
Sprawdź, dla jakich instytucji wykonujemy sekwencjonowanie NGS i w jakich publikacjach wykorzystano dostarczone przez nas dane.