Jednobuněčné ATAC-seq, tedy scATAC-seq, je metoda umožňující analýzu přístupnosti chromatinu na úrovni jednotlivých buněk. Umožňuje identifikovat otevřené oblasti chromatinu včetně potenciálně aktivních promotorů, enhancerů a vazebných míst transkripčních faktorů.
Na rozdíl od klasického ATAC-seq, které poskytuje průměrný profil celého vzorku, umožňuje scATAC-seq rozlišit signály jednotlivých buněčných populací. Díky tomu lze analyzovat heterogenní tkáně, identifikovat vzácné subpopulace a porovnávat mechanismy genové regulace mezi různými typy a stavy buněk.
Průběh jednobuněčného ATAC-seq
- Příprava materiálu a odstranění mrtvých buněkHodnotí se počet buněk, jejich životaschopnost a kvalita dodané suspenze. Pokud je podíl mrtvých buněk vysoký, lze je odstranit metodou využívající magnetické kuličky. Tím se vzorek obohatí o živé buňky a zlepší se kvalita materiálu určeného k izolaci buněčných jader.
- Izolace buněčných jader a rozdělení materiáluZ buněk se připraví homogenní suspenze buněčných jader. Přístupné oblasti chromatinu se následně označí pomocí transpozázy Tn5, která fragmentuje DNA a připojuje sekvenační adaptéry. Jádra se rozdělují v mikrofluidním systému společně s nosiči obsahujícími oligonukleotidy s čárovými kódy.
- Značení a příprava knihovenFragmenty DNA z každého jádra získají jedinečný čárový kód. Díky tomu lze po sekvenování přiřadit čtení jednotlivým buňkám. Označené fragmenty DNA se poté amplifikují a použijí k přípravě sekvenačních knihoven.
- SekvenováníKnihovny se sloučí do poolu a sekvenují na vysokokapacitní platformě Illumina. Paired-end sekvenování umožňuje určit polohu a délku fragmentů přístupného chromatinu.
- Bioinformatická analýzaČtení se na základě čárových kódů přiřazují jednotlivým jádrům a mapují na referenční genom. Analýza může zahrnovat kontrolu kvality dat, identifikaci oblastí otevřeného chromatinu, shlukování buněk, analýzu rozdílů v přístupnosti chromatinu a identifikaci potenciálních vazebných motivů transkripčních faktorů. Výsledky se předkládají ve formě zpráv, tabulek a vizualizací umožňujících porovnání buněčných populací.
Využití jednobuněčného ATAC-seq
ATAC-seq jako alternativa k ChIP-seq
ChIP-seq umožňuje identifikovat místa vazby konkrétního transkripčního faktoru nebo místa se specifickou modifikací histonů. Metoda však vyžaduje vhodnou validovanou protilátku a její použití může být omezeno malým množstvím biologického materiálu. Kvalita a specificita protilátky přímo ovlivňují spolehlivost získaných výsledků. ATAC-seq nevyžaduje protilátky a umožňuje současně analyzovat celkový profil otevřeného chromatinu. Na základě přístupnosti regulačních oblastí, sekvenčních motivů, které se v nich vyskytují, a analýzy footprintingu lze určit potenciální transkripční faktory zapojené do zkoumaného procesu. Jednobuněčné ATAC-seq navíc umožňuje přiřadit tyto rozdíly ke konkrétním buněčným populacím. ATAC-seq však nenahrazuje ChIP-seq při přímém potvrzování vazby konkrétního proteinu na DNA. Je zvláště užitečné při hledání potenciálních regulátorů, zejména pokud ještě není znám seznam transkripčních faktorů nebo nejsou k dispozici vhodné protilátky.
Požadavky na vzorky
Vstupním materiálem může být čerstvá nebo vhodně uchovaná tkáň, suspenze jednotlivých buněk nebo připravená suspenze buněčných jader. Zásadní je získat homogenní suspenzi jader se zachovanou integritou, malým počtem agregátů a omezeným množstvím buněčných fragmentů. Požadované množství materiálu a způsob jeho uchování závisí na druhu organismu, tkáni a plánovaném počtu analyzovaných jader.
Bioinformatická analýza jednobuněčného ATAC-seq
- kontrolu kvality a filtrování dat;
- mapování čtení na referenční genom;
- identifikaci oblastí otevřeného chromatinu;
- vytváření profilů přístupnosti chromatinu pro jednotlivá jádra;
- redukci dimenzionality a shlukování buněk;
- identifikaci oblastí s rozdílnou přístupností;
- analýzu promotorů a potenciálních enhancerů;
- analýzu motivů transkripčních faktorů;
- predikci aktivity genů;
- integraci s daty z jednobuněčného sekvenování RNA (scRNA-seq);
- porovnání buněčných populací mezi experimentálními skupinami.
Pro zjištění ceny služby doporučujeme vyplnit formulář specifikace projektu.