ChIP-seq (Chromatin Immunoprecipitation Sequencing), tedy sekvenování DNA po imunoprecipitaci chromatinu, umožňuje identifikovat oblasti genomu spojené s konkrétními proteiny, včetně transkripčních faktorů, a analyzovat rozložení modifikací histonů. Metoda kombinuje imunoprecipitaci chromatinu (ChIP) se sekvenováním nové generace (NGS).
Získaná data umožňují určit polohu oblastí obohacených o DNA vázanou na zkoumaný protein, analyzovat potenciální mechanismy genové regulace a porovnávat profily vazby proteinů a modifikací chromatinu mezi experimentálními podmínkami.
Služba zahrnuje přípravu knihoven z dodané ChIP DNA a jejich sekvenování. Nabízíme také možnost sekvenování hotových knihoven ChIP-seq připravených zákazníkem.
Průběh procesu ChIP-seq
V případě knihoven připravených přímo zákazníkem se tento krok vynechává.
Využití ChIP-seq
Technická charakteristika ChIP-seq
- Platforma: Illumina.
- Režim sekvenování: standardně PE150 (2 × 150 bp).
- Alternativní konfigurace: single-end sekvenování, včetně SE50, po potvrzení dostupnosti a kompatibility knihoven.
- Vstupní materiál: ChIP DNA nebo hotové knihovny ChIP-seq.
- Příprava knihoven: z DNA po imunoprecipitaci chromatinu.
- Doporučené množství dat: 10 Gb na vzorek ve standardní konfiguraci PE150 s možností přizpůsobení hloubky sekvenování.
10 Gb odpovídá přibližně 33 mil. párů čtení PE150 v plné délce. Skutečný počet fragmentů využitelných pro analýzu závisí na kvalitě knihoven, účinnosti mapování a míře duplikace čtení.
Při studiu rozsáhlých oblastí obohacení, např. u vybraných modifikací histonů, může být nutné zvýšit množství dat. Parametry volíme individuálně podle charakteristiky projektu.
Požadavky na vzorky
ChIP DNA pro přípravu knihoven
| Parametr | Doporučený požadavek |
|---|---|
| Typ vzorku | Purifikovaná ChIP DNA |
| Celkové množství | ≥50 ng preferováno |
| Minimální množství | ≥10 ng, po dohodě |
| Preferovaná koncentrace | ≥2 ng/µL |
| Objem | ≥25 µL |
| Délka fragmentů | 100-750 bp |
| Preferované hlavní rozmezí délek fragmentů | 200-600 bp |
| Čistota A260/A280 | 1,8-2,0 |
| Pufr | Voda bez nukleáz, EB nebo Low TE |
Vhodnost vzorků se posuzuje na základě kontroly kvality. V případě menšího množství materiálu je nutné možnost přípravy knihoven individuálně potvrdit.
Předem připravené knihovny ChIP-seq
Nabízíme sekvenování knihoven ChIP-seq připravených samotným zákazníkem bez nutnosti opakovat fázi přípravy knihoven.
Knihovny by měly být kompatibilní s platformou Illumina a obsahovat adaptéry a indexy umožňující správné sekvenování a identifikaci vzorků.
Před přijetím knihoven požadujeme informace o:
- Soupravě použité k přípravě knihoven.
- Koncentraci, objemu a distribuci délek fragmentů.
- Sekvencích a typu indexů (i7/i5).
- Plánované konfiguraci sekvenování (SE nebo PE).
- Cílovém počtu čtení nebo množství dat na vzorek.
Konečné požadavky na množství, koncentraci a objem knihoven se stanovují na základě parametrů plánovaného sekvenování. Před schválením k sekvenování procházejí knihovny kontrolou kvality.
Bioinformatická analýza ChIP-seq
Rozsah bioinformatické analýzy ChIP-seq může zahrnovat:
- Kontrolu kvality sekvenačních dat a filtraci čtení.
- Mapování čtení na referenční genom.
- Hodnocení kvality mapování, duplikace a obohacení signálu.
- Identifikaci oblastí obohacení (peak calling).
- Anotaci oblastí ve vztahu ke genům a regulačním elementům.
- Analýzu distribuce signálu v okolí míst zahájení transkripce (TSS).
- Identifikaci obohacených sekvenčních motivů (motif analysis).
- Funkční analýzu genů spojených s oblastmi obohacení, včetně GO a KEGG.
- Porovnání oblastí obohacení mezi experimentálními skupinami (differential peak analysis).
V závislosti na rozsahu projektu mohou výsledky zahrnovat soubory FASTQ, BAM, BED, bigWig a bioinformatické zprávy a vizualizace.
Rozsah analýzy přizpůsobujeme zkoumanému organismu, dostupnosti referenčního genomu, typu proteinu nebo modifikace histonu, počtu biologických replikátů a přítomnosti vhodných kontrolních vzorků.
U projektů zahrnujících pouze sekvenování předem připravených knihoven lze bioinformatickou analýzu objednat jako doplňkovou součást služby.