Metatranskriptomické sekvenování neboli Metatranscriptomic Seq umožňuje zkoumat genovou expresi ve složitých mikrobiálních společenstvech bez nutnosti jejich předchozí kultivace. Analýza zahrnuje RNA pocházející mimo jiné ze vzorků půdy, vody, stolice, střevního obsahu či stěrů.
Získaná data umožňují charakterizovat transkripční profil společenstva, přiřadit transkriptům biologické funkce a porovnat genovou expresi mezi experimentálními podmínkami. Metoda nachází uplatnění při výzkumu aktivity mikrobiomu a jeho reakce na změny prostředí nebo působení hostitele.
Průběh metatranskriptomického sekvenování
Využití metatranskriptomického sekvenování
Technická charakteristika metatranskriptomického sekvenování
- Platforma: Illumina.
- Režim sekvenování: PE150, tedy 2 × 150 bp.
- Příprava knihoven: vláknově specifické knihovny po depleci rRNA.
- Doporučené množství dat: 12 Gb na vzorek.
12 Gb odpovídá přibližně 40 milionům párů čtení PE150 v plné délce. Cílové množství dat volíme podle komplexity mikrobiomu, podílu hostitelské RNA a cíle studie. Počet čtení využitelných při analýze závisí také na účinnosti odstranění rRNA a filtraci dat.
Požadavky na vzorky
| Parametr | Požadavek |
|---|---|
| Typ vzorku | Celková RNA |
| Celkové množství | ≥1 µg |
| Koncentrace | ≥50 ng/µL |
| Objem | ≥20 µL |
| Integrita | RIN ≥6,5 |
| Čistota A260/A280 | 1,8-2,0 |
| Čistota A260/A230 | 1,0-2,5 |
RNA lze také izolovat z dodaného materiálu. Typ, množství a způsob uchování vzorků určených k izolaci je nutné předem dohodnout. Vhodnost materiálu pro přípravu knihoven se posuzuje na základě kontroly kvality.
Bioinformatická analýza metatranskriptomického sekvenování
Rozsah bioinformatické analýzy zahrnuje:
- Kontrolu kvality sekvenačních dat.
- Sestavování transkriptů.
- Taxonomickou anotaci a stanovení relativního podílu transkriptů přiřazených jednotlivým taxonům.
- Analýzu alfa a beta diverzity.
- Funkční anotaci s využitím databází GO, KEGG, eggNOG, CAZy, CARD a PHI.
- Kvantifikaci genové exprese a analýzu rozdílů mezi skupinami.
Taxonomický profil získaný z RNA závisí jak na zastoupení mikroorganismů ve vzorku, tak na jejich genové expresi. Rozsah analýz a porovnání přizpůsobujeme cíli projektu, dostupným metadatům a počtu biologických replikátů.
Popište projekt - vybereme vhodnou metodu a množství dat.