Celogenomové bisulfitové sekvenování (WGBS)

Celogenomové bisulfitové sekvenování je nejkomplexnější metodou analýzy metylace DNA, která umožňuje analyzovat vzorce metylace na úrovni jednotlivých nukleotidů v celém genomu. Technologie kombinuje chemickou bisulfitovou konverzi DNA se sekvenováním nové generace a zajišťuje nejvyšší rozlišení v epigenetickém výzkumu.

Metoda umožňuje identifikovat metylované cytosiny v genových i mezigenových oblastech a poskytuje úplný obraz epigenetických změn probíhajících ve zkoumaném biologickém materiálu.

Průběh procesu WGBS

Využití WGBS

WGBS nachází uplatnění v široké škále základního a aplikovaného výzkumu v oblasti epigenetiky.

Výzkum nádorových onemocnění

• identifikace epigenetických biomarkerů,
• analýza mechanismů rozvoje nádorů,
• studium nádorové heterogenity,
• sledování odpovědi na léčbu.

Translační medicína a diagnostika

• objevování diagnostických a prognostických markerů,
• výzkum genetických a epigenetických onemocnění,
• rozvoj personalizované medicíny.

Výzkum vývojových procesů

• analýza epigenetických změn během buněčné diferenciace,
• výzkum embryogeneze,
• hodnocení procesů stárnutí organismu.

Biologie rostlin a živočichů

• analýza regulace genové exprese,
• výzkum adaptace na prostředí,
• šlechtitelské projekty a funkční genomika.

Environmentální a toxikologický výzkum

• hodnocení vlivu faktorů prostředí na epigenom,
• výzkum odpovědi organismů na stres vyvolaný prostředím,
• analýza důsledků expozice chemickým látkám.

Technická charakteristika WGBS

• Režim sekvenování: 2 × 150 bp
• Sekvenátory: platforma Illumina, sekvenátory NovaSeq 6000 a NovaSeq X.
• Doporučená hloubka pokrytí genomu:
  • 30x na vzorek - minimálně 3 biologická opakování a dostupný referenční genom vysoké kvality
  • K dispozici jsou i další konfigurace podle potřeb zákazníka.
• Doporučené požadavky na vzorky:
  • Typ vzorku: genomová DNA
  • Množství: > 100 ng
  • Koncentrace (NanoDrop): >2 ng/μL
  • Objem: >20 μL
  • Bez degradace a kontaminace
• Možná je také izolace DNA z dodaných vzorků. Podrobnosti zde.

Bioinformatická analýza WGBS

Bioinformatická analýza dat WGBS zahrnuje vícestupňové zpracování a interpretaci výsledků sekvenování, které vedou ke komplexní charakterizaci metylomu zkoumaného organismu.

1. 01Kontrola kvality dat (Data Quality Control):Prvním krokem je posouzení kvality surových sekvenačních dat. Analyzují se parametry, jako jsou kvalita čtení, přítomnost adaptérů, míra duplikace a účinnost bisulfitové konverze. Na základě těchto výsledků se data před další analýzou filtrují a čistí.
2. 02Mapování na referenční genom.Filtrovaná čtení se mapují na odpovídající referenční genom pomocí algoritmů určených pro data po bisulfitové konverzi. Zpráva zahrnuje:
   • statistiky mapování čtení,
   • úspěšnost zarovnání na genom,
   • hloubku sekvenování,
   • hloubku pokrytí analyzovaných cytosinových pozic,
   • hodnocení úplnosti dat pro jednotlivé oblasti genomu.
3. 03Identifikace metylace DNA.Na základě namapovaných čtení se identifikují místa metylace DNA s rozlišením na úrovni jednotlivých nukleotidů. Analýza zahrnuje:
   • identifikaci metylovaných cytosinů (mC),
   • stanovení úrovně metylace v každém místě,
   • charakterizaci kontextů metylace:
     • mCG (CpG),
     • mCHG,
     • mCHH (kde H = A, T nebo C),
   • analýzu rozmístění metylovaných míst v genomu,
   • identifikaci sekvenčních motivů spojených s metylací.
4. 04Profilování metylace v celém genomuDalší fáze zahrnuje komplexní charakterizaci epigenetické krajiny zkoumaného genomu. V rámci analýzy se vytvářejí:
   • profily hustoty a rozmístění metylace v celém genomu,
   • úrovně metylace ve funkčních oblastech (promotory, exony, introny, mezigenové oblasti),
   • profily metylace v oblastech upstream a downstream od genů,
   • analýza metylace ostrůvků CpG, jejich okrajů (CpG shores) a sousedních oblastí,
   • anotace genů spojených s pozorovanými vzorci metylace.
5. 05Analýza rozdílů mezi skupinami.Ve srovnávacích projektech se provádí analýza diferenciální metylace mezi zkoumanými skupinami nebo experimentálními podmínkami. Zahrnuje:
   • identifikaci diferenciálně metylovaných oblastí (DMR - Differentially Methylated Regions),
   • anotaci DMR ve vztahu ke genům a regulačním prvkům,
   • identifikaci genů spojených s diferenciální metylací,
   • analýzu funkčního obohacení GO (Gene Ontology),
   • analýzu biologických drah KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes),
   • biologickou interpretaci epigenetických změn v kontextu zkoumaného procesu nebo fenotypu.

Konečným výstupem je podrobná zpráva obsahující profily metylace, výsledky statistických analýz, identifikaci oblastí diferenciální metylace a funkční interpretaci získaných výsledků.