Prostorová transkriptomika (Spatial Transcriptomics) je pokročilá metoda analýzy genové exprese, která umožňuje zachovat informaci o původní poloze transkriptů ve zkoumaném úseku tkáně. Na rozdíl od klasického RNA-seq, při němž se RNA izoluje z homogenizovaného materiálu, propojuje prostorová transkriptomika údaje o genové expresi s histologickým obrazem vzorku. Díky tomu lze určit, které geny jsou aktivní v jednotlivých oblastech tkáně, identifikovat oblasti s odlišnými molekulárními profily a analyzovat vztahy mezi strukturou tkáně a biologickými procesy, které v ní probíhají. Metodu lze využít k analýze živočišných i rostlinných tkání. Je zvláště přínosná ve studiích, v nichž má prostorové uspořádání buněk a tkáňových struktur zásadní význam pro správnou interpretaci výsledků.
Využití prostorové transkriptomiky
Prostorová transkriptomika nachází uplatnění mimo jiné v:
Metoda je zvláště cenná v onkologii, imunologii, neurobiologii, vývojové biologii, výzkumu regenerace a při analýzách komplexních rostlinných a živočišných tkání.
Postup prostorové transkriptomiky
Technické parametry prostorové transkriptomiky
Výsledné množství dat lze přizpůsobit typu tkáně, ploše, kterou vzorek zaujímá, složitosti transkriptomu a cíli projektu.
Požadavky na živočišné vzorky
- Materiál by měl být odebrán ze živého nebo nedávno usmrceného organismu a co nejrychleji zabezpečen. Před zalitím je třeba odstranit přebytečnou pojivovou a tukovou tkáň, krev a další složky, které nebudou předmětem analýzy.
- Povrch vzorku je třeba jemně opláchnout vychlazeným pufrem PBS bez RNáz nebo fyziologickým roztokem a poté opatrně osušit.
- U nádorových vzorků je třeba správně oddělit nádorovou tkáň od přilehlé tkáně. Větší fragmenty by měly být oříznuty na rozměry odpovídající ploše záchytné oblasti.
- Pro každý vzorek se doporučuje připravit alespoň dva bloky OCT:
- první pro kontrolu kvality, výběr vhodného řezu, optimalizaci permeabilizace a samotný experiment,
- druhý jako záložní materiál.
- Pro většinu živočišných tkání je vhodné rychlé zmrazení na suchém ledu. U malých bioptických vzorků, mozku, edematózních tkání a materiálů náchylných k tvorbě ledových krystalů lze doporučit zmrazení v isopentanu chlazeném kapalným dusíkem.
- Pokud materiál nelze okamžitě zalít, lze tkáň dočasně uchovávat při teplotě 4 °C ve vhodném pufru nebo roztoku pro uchovávání tkání. Doba takového uchovávání by měla být co nejkratší, protože může ovlivnit integritu RNA.
Požadavky na rostlinné vzorky
- Čerstvý rostlinný materiál by měl být odebírán čistými nástroji bez RNáz, ideálně vychlazenými přibližně na 4 °C. Z povrchu vzorku je třeba odstranit zeminu, kultivační médium a další nečistoty.
- Tkáň lze jemně opláchnout ultračistou vodou a poté odstranit části, které nebudou předmětem analýzy. Během přípravy je třeba zachovat správnou strukturu a orientaci vybraného fragmentu.
- Vzhledem k rozdílům ve stavbě rostlinných tkání by měl být způsob zalévání přizpůsoben typu materiálu.
- Tkáně obsahující prostory nebo dutiny, například mladé pupeny, květní pupeny, semena, stonky a některé kořeny, mohou před zmrazením vyžadovat vakuovou infiltraci zředěným OCT.
- Tkáně bez větších prostor, například listy, postranní kořeny, kořenové vrcholy nebo kalus, lze přímo zalít do OCT a rychle zmrazit na suchém ledu.
- Je-li k dispozici dostatečné množství materiálu, doporučuje se pro každý vzorek připravit tři až pět bloků. To je zvlášť důležité u tenkých, jemných nebo obtížně orientovatelných rostlinných struktur. Další bloky mohou být potřebné pro:
- kontrolu kvality RNA,
- posouzení struktury tkáně,
- výběr vhodné úrovně řezu,
- optimalizaci permeabilizace,
- provedení samotného experimentu.
Zalévání vzorků do OCT
Tkáň by měla být zcela obklopena OCT a umístěna v souladu s plánovaným směrem krájení. Nesprávná orientace vzorku, přítomnost vzduchových bublin nebo zřasení materiálu mohou ztížit přípravu řezů a zmenšit plochu dostupnou pro analýzu.
Pokud se do jednoho bloku zalévá několik malých fragmentů, měly by:
- být ve stejné rovině,
- být umístěny blízko sebe, ale nepřekrývat se,
- dohromady zabírat alespoň přibližně 25 % záchytné oblasti,
- být umístěny v dostatečné vzdálenosti od okrajů a dna formičky.
Uchovávání a přeprava
Bloky zalité v OCT by měly být řádně označeny, chráněny hliníkovou fólií nebo těsným obalem a uchovávány při teplotě -80 °C nebo v kapalném dusíku. Přeprava by měla probíhat na suchém ledu tak, aby nedošlo k rozmrazení vzorků. I krátkodobé rozmrazení může zhoršit morfologii tkáně a kvalitu RNA.
Kontrola kvality řezů
Před provedením samotného experimentu se hodnotí morfologická kvalita tkáně a integrita RNA. Morfologické hodnocení umožňuje potvrdit, že:
- řez obsahuje požadovanou oblast tkáně,
- struktura tkáně zůstala zachována,
- vzorek neobsahuje výrazné trhliny, přehyby ani zvrásnění,
- nejsou přítomny velké vzduchové bubliny,
- nejsou patrné významné artefakty vzniklé při zmrazování.
U živočišných tkání se obvykle používá barvení H&E, zatímco u rostlinných tkání lze použít barvení toluidinovou modří. RNA izolovaná z reprezentativních řezů se hodnotí pomocí přístroje Agilent 2100 Bioanalyzer nebo rovnocenného systému. Pro další realizaci projektu se doporučuje hodnota RIN alespoň 6.
Bioinformatická analýza prostorové transkriptomiky
Standardní bioinformatická analýza zahrnuje:
- kontrolu kvality a hodnocení sekvenačních dat,
- mapování čtení na referenční genom,
- identifikaci a kvantifikaci genů v jednotlivých prostorových bodech,
- hodnocení šíře pokrytí tkáně,
- stanovení počtu genů detekovaných v jednotlivých bodech,
- integraci výsledků sekvenování s histologickým obrazem,
- vizualizaci prostorových profilů genové exprese,
- shlukování bodů na základě jejich expresních profilů,
- identifikaci genů charakteristických pro jednotlivé shluky,
- analýzu genů odlišujících shluky a oblasti tkáně,
- funkční anotaci genů,
- analýzu funkčního obohacení,
- integraci dat z více vzorků,
- společné shlukování prostorových dat,
- analýzu rozdílů mezi experimentálními skupinami.
Rozsah analýzy lze rozšířit o další nestandardní analýzy, integraci s daty z jednobuněčného sekvenování RNA (scRNA-seq) a vizualizace přizpůsobené cíli projektu a specifikům zkoumaného materiálu.