Illumina se nejčastěji volí pro projekty vyžadující velké množství velmi přesných krátkých čtení, jako je resekvenování genomu, RNA-seq nebo identifikace variant SNP. PacBio se osvědčuje tam, kde jsou zapotřebí přesná dlouhá čtení HiFi, zatímco Oxford Nanopore Technologies - ONT je zvláště vhodný pro získávání velmi dlouhých a ultradlouhých čtení, analýzu modifikací DNA a přímé sekvenování RNA.
Není vždy nutné zvolit pouze jednu platformu. Při sestavování genomů de novo často přináší nejlepší výsledky kombinace dlouhých čtení PacBio nebo ONT s krátkými čteními Illumina a daty Hi-C.
Porovnání technologií
| Kritérium | Illumina | PacBio HiFi | Oxford Nanopore - ONT |
|---|---|---|---|
| Typ čtení | Krátká | Dlouhá, vysoce přesná | Dlouhá a ultradlouhá |
| Typická délka čtení | Nejčastěji 2 × 150 bp | Obvykle od více než deseti do několika desítek kb | Od několika kb do více než 100 kb u knihoven ultra-long |
| Přesnost jednotlivého čtení | Velmi vysoká | Velmi vysoká - HiFi | Vysoká, závisí na chemii, kvalitě DNA a basecallingu |
| Propustnost | Velmi vysoká | Vysoká | Škálovatelná podle přístroje a průtokové cely |
| SNP a malé indely | Velmi vhodné | Velmi vhodné | Možné, obvykle při dostatečné hloubce pokrytí a vhodném postupu zpracování dat |
| Strukturní varianty | Omezené možnosti | Velmi vhodné | Velmi vhodné |
| Repetitivní oblasti | Obtížněji rozlišitelné | Velmi vhodné | Obzvláště vhodné díky velmi dlouhým čtením |
| Haplotypování | Omezené krátkou délkou čtení | Ano | Ano |
| Sestavování genomu de novo | Obvykle nedostačující jako jediný zdroj dat | Ano | Ano |
| Analýza metylace DNA | Vyžaduje doplňkový protokol, např. WGBS | Možná z nativní DNA | Možná z nativní DNA |
| Transkripty v plné délce | Ne v jediném čtení | Ano - Iso-Seq | Ano - cDNA nebo direct RNA |
| Přímé sekvenování RNA | Ne | Ne ve standardním pracovním postupu | Ano |
| Analýza v reálném čase | Ne | Ne | Ano |
| Největší výhoda | Přesnost, propustnost a jednotkové náklady | Kombinace délky a přesnosti | Nejdelší čtení a flexibilita |
Kdy zvolit Illumina?
Zvolte Illumina, pokud:
- plánujete resekvenování genomu s využitím kvalitního referenčního genomu,
- je hlavním cílem identifikace SNP a malých indelů,
- analyzujete genovou expresi metodou mRNA-seq nebo sekvenování celkové RNA,
- provádíte WES, WGBS, ChIP-seq nebo ATAC-seq,
- analyzujete velký počet vzorků,
- potřebujete vysokou propustnost a nízké náklady na jednu bázi,
- provádíte amplikonové sekvenování nebo shotgun metagenomiku,
- nepotřebujete čtení pokrývající dlouhé repetitivní oblasti.
Illumina využívá technologii sequencing by synthesis. Nejčastěji se generují paired-end čtení o délce 2 × 150 bp. Krátká čtení mají vysokou kvalitu, ale nemusí stačit k jednoznačnému sestavení repetitivních oblastí, identifikaci složitých strukturních variant nebo rozlišení haplotypů.
Kdy zvolit PacBio HiFi?
Zvolte PacBio, pokud:
- je cílem sestavování genomu de novo,
- potřebujete přesná dlouhá čtení,
- analyzujete složité strukturní varianty,
- chcete rozlišit haplotypy,
- je zkoumaný genom polyploidní, heterozygotní nebo bohatý na repetitivní sekvence,
- plánujete analýzu transkriptů v plné délce metodou Iso-Seq,
- chcete současně analyzovat sekvenci i modifikace DNA,
- potřebujete vysokou přesnost konsenzuální sekvence bez korekce pomocí krátkých čtení.
Technologie PacBio HiFi je založena na opakovaném čtení téže kruhové molekuly. Z těchto čtení se vytváří konsenzuální sekvence, která spojuje délku čtení s velmi vysokou přesností.
PacBio je obzvláště vhodnou volbou pro tvorbu vysoce kvalitních referenčních genomů a analýzu strukturních variant. Pro získání genomu sestaveného na úrovni chromozomů lze data HiFi kombinovat s Hi-C.
Kdy zvolit Oxford Nanopore Technologies?
Zvolte ONT, pokud:
- potřebujete velmi dlouhá nebo ultradlouhá čtení,
- je cílem sestavování genomu de novo a propojování vzdálených oblastí,
- analyzujete složité přestavby a strukturní varianty,
- chcete provádět sekvenování a analýzu dat v reálném čase,
- analyzujete metylaci bez předchozí bisulfitové konverze,
- chcete sekvenovat molekuly RNA v plné délce,
- zajímá vás přímé sekvenování RNA.
Délka čtení ONT závisí především na délce a kvalitě vstupních molekul. Technologie dokáže generovat čtení delší než 100 kb a za vhodných podmínek i výrazně delší.
ONT umožňuje přímo analyzovat nativní DNA i RNA. Je proto obzvláště zajímavou volbou pro projekty zaměřené na modifikace bází, transkripty v plné délce a heterogenitu molekul RNA.
Požadavky na vzorky
Přesné požadavky závisí na aplikaci, organismu, zvoleném protokolu a očekávané délce čtení.
Illumina
Nejčastěji se vyžaduje:
- purifikovaná DNA nebo RNA v odpovídajícím množství a koncentraci,
- nepřítomnost inhibitorů enzymatických reakcí,
- dobrá čistota potvrzená měřením OD260/280 a OD260/230,
- odpovídající integrita RNA v projektech RNA-seq,
- DNA může být během přípravy knihovny fragmentována.
Illumina nevyžaduje zachování velmi dlouhých molekul DNA, proto může mít materiál nižší integritu než v projektech využívajících dlouhá čtení. Míra degradace však může i nadále ovlivňovat kvalitu knihovny a rozsah možných analýz.
PacBio HiFi
Nejčastěji se vyžaduje:
- vysokomolekulární DNA - HMW DNA,
- co nejmenší mechanická fragmentace materiálu,
- vysoká čistota a nepřítomnost inhibitorů,
- množství DNA odpovídající zvolenému protokolu a velikosti genomu,
- spolehlivé stanovení koncentrace fluorometrickou metodou,
- kontrola délky fragmentů.
Pro analýzu Iso-Seq je vyžadována kvalitní RNA, protože degradace může znemožnit získání kompletních transkriptů.
Oxford Nanopore Technologies
Nejčastěji se vyžaduje:
- vysokomolekulární nebo ultravysokomolekulární DNA,
- šetrná izolace omezující střižné poškození DNA,
- vysoká čistota vzorku,
- nepřítomnost zbytků solí, alkoholu, detergentů a dalších inhibitorů,
- dostatečné množství materiálu pro zvolenou soupravu a flow cell.
Pokud jsou cílem ultradlouhá čtení, patří způsob izolace a zacházení s DNA k nejdůležitějším aspektům celého projektu. Intenzivní pipetování, vortexování, opakované zmrazování nebo nevhodná přeprava mohou molekuly výrazně zkrátit.
Pro direct RNA sequencing je vyžadována nativní RNA splňující požadavky konkrétního protokolu ONT.
Orientační objem dat
Množství dat je třeba zvolit na základě velikosti genomu, ploidie, heterozygotnosti, typu analýzy a očekávané hloubky pokrytí.
Illumina
Orientační hodnoty:
- resekvenování genomu: obvykle přibližně 20-30×,
- analýza lidského WGS: nejčastěji přibližně 30×,
- sestavování malého genomu mikroorganismu: často alespoň 50-100×,
- sekvenování mRNA: zpravidla přibližně 20-30 mil. párů čtení na vzorek,
- projekty zaměřené na analýzu slabě exprimovaných transkriptů nebo nových izoforem mohou vyžadovat větší množství dat.
PacBio HiFi
Orientační hodnoty:
- sestavování genomu de novo: zpravidla přibližně 20-30×,
- heterozygotní, polyploidní nebo zvláště komplexní genomy mohou vyžadovat větší hloubku pokrytí,
- analýza strukturních variant a haplotypizace: rozsah je třeba přizpůsobit organismu a cíli projektu,
- Iso-Seq: množství dat závisí na komplexitě transkriptomu a počtu zkoumaných tkání nebo podmínek.
Oxford Nanopore Technologies
Orientační hodnoty:
- sestavování genomu de novo: často přibližně 30-40×,
- analýza strukturních variant: obvykle alespoň s hloubkou pokrytí v řádu nižších až vyšších desítek ×, podle cíle,
- ultradlouhá čtení jako doplněk sestavování genomu: množství se volí individuálně,
- direct RNA nebo sekvenování transkriptomu v plné délce: množství dat závisí na počtu vzorků, komplexitě transkriptomu a očekávané citlivosti.
U projektů de novo by se množství dat mělo vypočítat v gigabázích na základě odhadované velikosti genomu:
množství dat = velikost genomu × plánovaná hloubka pokrytí
Vyplatí se kombinovat technologie?
Ano. Hybridní přístup může poskytnout úplnější informace než použití jediné platformy.
Nejčastěji se používají tyto kombinace:
Volba takového přístupu by měla vycházet z konkrétního cíle, a nikoli z předpokladu, že větší počet technologií vždy zlepší výsledek.
Typické chyby při výběru technologie
Otázky pro plánování projektu
Před výběrem technologie si položte následující otázky:
Naplánujte si projekt
Popište projekt - vybereme vhodnou metodu a množství dat.
Na základě zkoumaného organismu, kvality materiálu a cíle analýzy vám pomůžeme vybrat Illumina, PacBio, Oxford Nanopore nebo hybridní přístup. Stanovíme také požadovanou hloubku pokrytí, způsob přípravy vzorků a vhodný rozsah bioinformatické analýzy.