Sekvenování amplikonů a shotgun metagenomika jsou dvě základní metody studia mikrobiomu. Obě umožňují charakterizovat společenstva mikroorganismů, liší se však rozsahem získaných informací, rozlišovací schopností, požadavky na vzorky i náklady.
Volba metody by se měla řídit především cílem studie. Pokud chceme porovnat složení určité skupiny mikroorganismů v mnoha vzorcích, obvykle postačí sekvenování amplikonů vhodného markeru. Pokud projekt zahrnuje také analýzu funkčního potenciálu celého společenstva, je vhodnější shotgun metagenomika.
V čem spočívá sekvenování amplikonů?
Sekvenování amplikonů je cílená metoda. Spočívá v amplifikaci vybraného taxonomického markeru pomocí PCR a následném sekvenování získaných produktů.
Typ markeru se volí podle zkoumané skupiny mikroorganismů:
Sekvenování amplikonů poskytuje především informace o relativním taxonomickém složení zkoumané skupiny mikroorganismů. Neumožňuje přímou analýzu aktivity genů u zkoumaných mikroorganismů.
Kdy zvolit sekvenování amplikonů?
Sekvenování amplikonů je vhodné, pokud:
- je cílem určit složení bakterií, archeí, hub nebo jiných vybraných mikroorganismů,
- chceme porovnat mikrobiální diverzitu mezi vzorky,
- analyzujeme velký počet vzorků,
- máme k dispozici malé množství DNA,
- má projekt screeningový charakter,
- je důležité omezit náklady,
- není vyžadována přímá analýza genů a metabolických drah.
Metoda se osvědčuje například při studiu mikrobiomu půdy, vody, trávicího traktu, rostlinného materiálu, potravin a klinických vzorků.
V čem spočívá shotgun metagenomika?
Při shotgun metagenomice se sekvenuje veškerá DNA přítomná ve vzorku bez předchozí amplifikace jediného taxonomického markeru. Analýza tak může současně zahrnovat genetický materiál bakterií, archeí, hub, DNA virů a dalších organismů, pokud je jejich DNA ve vzorku přítomna a je dosaženo dostatečné hloubky sekvenování.
Shotgun metagenomika umožňuje nejen určit taxonomické složení, ale také identifikovat geny a předpovídat metabolické dráhy. Umožňuje odhalit mimo jiné geny rezistence vůči antibiotikům, faktory virulence a potenciální metabolické funkce mikrobiomu.
Je však třeba mít na paměti, že přítomnost určitého genu vypovídá o funkčním potenciálu společenstva, nikoli o jeho skutečné aktivitě. Ke studiu aktivně exprimovaných genů se používá metatranskriptomika.
Kdy zvolit shotgun metagenomiku?
Shotgun metagenomika je vhodnou volbou, pokud:
- chceme analyzovat různé skupiny mikroorganismů bez omezení studie na jediný marker,
- je zapotřebí co nejvyšší taxonomická rozlišovací schopnost,
- je cílem analyzovat funkční potenciál mikrobiomu,
- chceme identifikovat geny rezistence, virulence nebo vybrané metabolické dráhy,
- plánujeme rekonstrukci genomů mikroorganismů, tzv. MAGs,
- chceme předejít omezením vyplývajícím z volby primerů a amplifikace PCR.
Metoda však vyžaduje větší množství dat, rozsáhlejší bioinformatickou analýzu a obvykle vyšší rozpočet.
Hlavní rozdíly
| Kritérium | Sekvenování amplikonů | Shotgun metagenomika |
|---|---|---|
| Rozsah analýzy | Vybraná skupina mikroorganismů | Všechny frakce DNA přítomné ve vzorku |
| Analyzovaný materiál | Vybraný marker, např. 16S, ITS nebo 18S | Veškerá DNA |
| Bakterie a archea | Marker 16S rRNA | Analyzovány společně s ostatní DNA |
| Houby | Marker ITS | Analyzovány společně s ostatní DNA |
| Taxonomické informace | Závisí na markeru a analyzované oblasti | Obvykle vyšší rozlišovací schopnost |
| Funkční analýza | Omezená nebo prediktivní | Přímá identifikace genů a potenciálních funkcí |
| Cílená amplifikace PCR | Ano | Ne |
| Nároky na množství dat | Menší | Větší |
| Bioinformatická analýza | Méně složitá | Složitější |
| Náklady | Nižší | Vyšší |
| Analýza velkých kohort | Obzvláště výhodná | Možná, ale nákladnější |
Na co je třeba pamatovat před volbou metody?
V případě Amplicon Sequencing závisí výsledek na zvoleném markeru, amplifikované oblasti, použitých primerech a kvalitě i úplnosti referenčních databází. Při amplifikaci PCR může docházet k přednostní amplifikaci DNA určitých skupin mikroorganismů, což ovlivňuje pozorovaný profil společenstva.
Pokud projekt zahrnuje současnou analýzu bakterií a hub, je nutné připravit samostatné knihovny pro markery 16S rRNA a ITS. Tyto markery se neanalyzují v rámci jedné amplifikační reakce.
U shotgun metagenomiky hraje zvlášť důležitou roli podíl DNA hostitele. V lidských, živočišných nebo rostlinných vzorcích může tvořit značnou část všech čtení, čímž se snižuje množství dat připadajících na mikroorganismy. To může vyžadovat zvýšení hloubky sekvenování nebo použití metod pro snížení podílu DNA hostitele.
U obou přístupů mají získané výsledky nejčastěji relativní charakter. Pokud je cílem určit absolutní početnost mikroorganismů, je vhodné projekt doplnit o kvantitativní standardy nebo metody, jako je qPCR.
Kterou metodu zvolit?
Zvolte Amplicon Sequencing, pokud chcete nákladově efektivně porovnat složení určité skupiny mikroorganismů ve velkém počtu vzorků. Pro analýzu bakterií a archeí zvolte marker 16S rRNA, pro studium hub pak oblast ITS.
Zvolte shotgun metagenomiku, pokud potřebujete komplexní charakteristiku mikrobiomu bez omezení analýzy na jediný marker a informace o genech a funkčním potenciálu celého společenstva.
Volba vhodné metody závisí také na typu materiálu, počtu vzorků, očekávaném podílu hostitelské DNA, požadovaném rozlišení a dostupném rozpočtu. Sdělte nám informace o vzorcích a cíli výzkumu a my vám pomůžeme vybrat vhodný marker, technologii sekvenování, objem dat a rozsah bioinformatické analýzy.
Vybrané realizované projekty a publikace našich zákazníků
Podívejte se, pro které instituce provádíme sekvenování NGS a v jakých publikacích byla využita námi dodaná data.