ATAC-seq (Assay for Transposase-Accessible Chromatin Sequencing) je moderní epigenomická metoda umožňující identifikovat oblasti otevřeného chromatinu v celém genomu. Využívá hyperaktivní transpozázu Tn5, která současně štěpí DNA a připojuje sekvenační adaptéry k přístupným oblastem chromatinu. Díky tomu lze mapovat regulační prvky genomu, jako jsou promotory, enhancery či vazebná místa transkripčních faktorů.
Průběh procesu ATAC-seq
01Izolace buněk nebo buněčných jader: Analýza začíná přípravou vysoce kvalitního biologického materiálu. V závislosti na typu vzorku lze použít celé buňky nebo izolovaná buněčná jádra.
02Tagmentace chromatinu: Klíčovým krokem metody je tagmentační reakce. Hyperaktivní transpozáza Tn5 rozpoznává oblasti otevřeného chromatinu, v nichž DNA není těsně vázána na nukleosomy. Tento proces umožňuje selektivně obohatit knihovnu o fragmenty pocházející z regulačních oblastí genomu. Enzym současně:
- štěpí DNA,
- vnáší sekvenační adaptéry,
- připravuje materiál k další amplifikaci.
03Příprava knihoven: Získané fragmenty DNA se amplifikují metodou PCR. V této fázi se zvyšuje množství materiálu potřebného pro sekvenování a přidávají se indexy umožňující analýzu více vzorků v jednom sekvenačním běhu.
04Kontrola kvality knihoven: Před sekvenováním se hodnotí kvalita připravených knihoven, včetně jejich koncentrace a rozložení délek fragmentů DNA. Charakteristickým ukazatelem správně připravené knihovny ATAC-seq je přítomnost fragmentů odpovídajících oblastem bez nukleosomů (nucleosome-free regions, NFR) a také fragmentů DNA vázaných na jeden či více nukleosomů. Rozložení délek fragmentů může vykazovat charakteristickou periodicitu, která odráží uspořádání nukleosomů v chromatinu.
05Sekvenování: Připravené knihovny se sekvenují na platformě Illumina, nejčastěji v režimu paired-end (PE150). Sekvenování obou konců fragmentů DNA umožňuje přesné mapování čtení na referenční genom a určení délky fragmentů, což je důležité pro identifikaci oblastí otevřeného chromatinu a analýzu uspořádání nukleosomů.
06Bioinformatická analýza: Získaná data procházejí kontrolou kvality, filtrací a mapováním na referenční genom. Následně se identifikují oblasti otevřeného chromatinu (peak calling), které se dále zpracovávají pomocí genomové anotace a analýzy vazebných motivů transkripčních faktorů. V projektech zahrnujících různé experimentální skupiny se provádí také analýza diferenciální přístupnosti chromatinu, která umožňuje určit regulační oblasti potenciálně zapojené do zkoumaných biologických procesů.
Využití ATAC-seq
ATAC-seq poskytuje informace o regulačním prostředí genomu a využívá se v mnoha oblastech biologického a biomedicínského výzkumu.
01Identifikace oblastí otevřeného chromatinu - základním využitím metody je detekce aktivních regulačních oblastí, které se mohou podílet na řízení genové exprese.
02Analýza vazebných míst transkripčních faktorů - data ATAC-seq umožňují identifikovat potenciální vazebná místa transkripčních faktorů pomocí analýzy tzv. footprintingu.
03Mapování enhancerů a promotorů - ATAC-seq umožňuje odhalovat nové regulační prvky genomu a určovat jejich aktivitu v různých typech buněk.
04Výzkum nádorových onemocnění - tato technika se široce využívá k identifikaci epigenetických změn spojených s nádorovou transformací, progresí onemocnění a odpovědí na léčbu.
05Výzkum vývoje a kmenových buněk - ATAC-seq umožňuje sledovat dynamické změny přístupnosti chromatinu během diferenciace buněk a vývoje organismů.
06Imunologický výzkum - metoda umožňuje analyzovat aktivaci lymfocytů, imunitní odpověď a mechanismy regulace genů zapojených do fungování imunitního systému.
Technické parametry ATAC-seq
- Režim sekvenování: 2 × 150 bp
- Sekvenátory: platforma Illumina, sekvenátory NovaSeq 6000 a NovaSeq X.
- Doporučené množství dat na vzorek:
- 50 mil. čtení na vzorek - minimálně 3 biologická opakování a dostupný vysoce kvalitní referenční genom
- K dispozici jsou i další konfigurace podle potřeb zákazníka.
- Doporučené požadavky na vzorky:
- Typ vzorku:
- Buňky / jádra: > 5x105
- Tkáně: > 100 mg
- Krev: > 2 mL
- Typ vzorku:
Bioinformatická analýza ATAC-seq
Analýza dat ATAC-seq zahrnuje řadu kroků umožňujících identifikovat oblasti otevřeného chromatinu, určit jejich biologickou funkci a porovnat změny přístupnosti chromatinu mezi zkoumanými skupinami.
- Analýza jednotlivého vzorku (analýza v rámci vzorku)
- Kontrola kvality dat (QC) - Hodnotí se kvalita surových čtení, míra duplikace, obsah adaptérů a úspěšnost mapování na referenční genom.
- Mapování čtení na referenční genom - Čtení se zarovnávají k referenčnímu genomu, což umožňuje určit jejich polohu a vyhodnotit rozložení signálu ATAC-seq v genomu.
- Identifikace oblastí otevřeného chromatinu (Peak Calling) - Na základě hustoty čtení se identifikují tzv. píky odpovídající oblastem přístupného chromatinu, jako jsou promotory, enhancery či jiné regulační prvky.
- Anotace píků - Detekované píky se přiřazují k funkčním prvkům genomu, jako jsou promotory, exony, introny, mezigenové oblasti či enhancery.
- Analýza sekvenčních motivů a predikce transkripčních faktorů - Analýza obohacení motivů DNA umožňuje identifikovat potenciální transkripční faktory odpovědné za regulaci genové exprese ve zkoumaných buňkách.
- Funkční analýza genů souvisejících s píky: Geny nacházející se v blízkosti oblastí otevřeného chromatinu se podrobují funkční analýze zahrnující:
- analýzu genové ontologie (GO),
- analýzu biologických drah KEGG,
- analýzu funkčního obohacení.
ROZSAH BIOINFORMATICKÉ ANALÝZY4 analýzy
Srovnávací analýza mezi skupinami (meziskupinová analýza)U studií zahrnujících různé experimentální podmínky nebo biologické skupiny se provádí diferenciální analýza.
- Korelační analýza vzorků - Biologická a technická shoda mezi vzorky se hodnotí pomocí korelační analýzy a shlukování vzorků statistickými metodami.
Identifikace diferenciálně přístupných oblastí chromatinuPorovnání skupin umožňuje odhalit oblasti s významně zvýšenou nebo sníženou přístupností chromatinu (Differentially Accessible Regions, DARs).
Analýza motivů v diferenciálních pícíchU oblastí vykazujících významné změny přístupnosti se provádí analýza regulačních motivů, která umožňuje určit potenciální transkripční faktory odpovědné za pozorované rozdíly.
Funkční analýza genů spojených s diferenciálními píkyGeny spojené s oblastmi chromatinu s rozdílnou přístupností se podrobují analýze GO a KEGG a analýze funkčního obohacení, což umožňuje identifikovat biologické procesy a molekulární dráhy související se zkoumaným jevem.
SOUVISEJÍCÍ ČLÁNKY
ChIP-seqJednobuněčné ATAC-seqEPIGENOMIKA & 3D GENOMCelogenomové bisulfitové sekvenování (WGBS)Sekvenování Hi-CSrovnání: Illumina a AVITIKLÍČOVÁ SLOVA
ATAC-seqpřístupnost chromatinupřístupnost chromatinuotevřený chromatinregulace genomu
Byl vám tento článek užitečný?
Vaše odpověď nám pomáhá zlepšovat znalostní bázi.
Děkujeme - pomáhá nám to.
Děkujeme. Co chybělo?
Stačí jedna věta - dostane se k osobě, která má tento článek na starosti.
Děkujeme za připomínku.