Sekvenování RNA jednotlivých jader a jednobuněčné sekvenování RNA jsou metody umožňující analýzu genové exprese na úrovni jednotlivých buněčných jader. Umožňují charakterizovat heterogenitu komplexních tkání, identifikovat typy a subpopulace buněk a určit jejich charakteristické profily genové exprese. Na rozdíl od klasického RNA-seq, které poskytuje průměrný expresní profil celého vzorku, umožňuje sekvenování RNA jednotlivých jader (snRNA-seq) rozlišit signál pocházející z jednotlivých buněčných populací. Díky tomu lze identifikovat i vzácné subpopulace, jejichž přítomnost může při analýze celé tkáně zůstat skryta. Metoda využívá technologii 10x Genomics Chromium k oddělování jednotlivých jader a značení molekul RNA, které z nich pocházejí, individuálními čárovými kódy. Je obzvláště vhodná pro zmrazený materiál, tkáně obtížně podléhající disociaci a vzorky, z nichž nelze získat kvalitní suspenzi celých buněk
Průběh procesu 10x Genomics RNA-seq
Využití 10x Genomics RNA-seq
Sekvenování RNA jednotlivých jader, nebo jednobuněčné sekvenování RNA?
Volba mezi analýzou jednotlivých jader a analýzou celých buněk závisí především na typu a způsobu uchování biologického materiálu.
Sekvenování RNA jednotlivých jader:
- umožňuje analyzovat zmrazený materiál,
- lze je použít u tkání, které se obtížně rozdělují na jednotlivé buňky,
- není omezeno velikostí celých buněk v takové míře jako scRNA-seq,
- může omezit změny exprese vyvolané dlouhodobým enzymatickým štěpením,
- umožňuje analyzovat velké, křehké nebo mnohojaderné buňky,
- zahrnuje především RNA přítomnou v buněčném jádře.
- obvykle vyžaduje čerstvý materiál,
- vyžaduje přípravu kvalitní suspenze jednotlivých živých buněk,
- zahrnuje RNA přítomnou jak v jádře, tak v cytoplazmě,
- může být omezeno velikostí buněk a jejich náchylností k poškození,
- enzymatická disociace tkáně může vyvolat stresovou odpověď a změnit profil genové exprese.
Při sekvenování RNA jednotlivých jader (snRNA-seq) se analyzuje jaderný transkriptom, proto získaný profil není totožný s profilem celé buňky. Výběr metody by měl zohledňovat charakter tkáně, způsob uchovávání vzorků a biologický cíl projektu.
Technická charakteristika 10x Genomics RNA-seq
Parametry sekvenování a cílový počet jader/buněk by měly být stanoveny individuálně podle typu materiálu a cíle experimentu.
Požadavky na vzorky
Orientační požadavky na množství materiálu:
- živočišná tkáň: nejméně 200 mg,
- rostlinná tkáň: nejméně 400 mg.
Uvedené hodnoty jsou orientační. Skutečné požadované množství materiálu závisí mimo jiné na typu tkáně, velikosti a počtu buněčných jader / buněk, obsahu pojivové tkáně, přítomnosti sekundárních metabolitů, způsobu uchovávání a očekávaném počtu analyzovaných jader/buněk.
Před zahájením projektu doporučujeme konzultovat typ materiálu, způsob jeho odběru, zajištění a přepravy.
Bioinformatická analýza 10x Genomics RNA-seq
Bioinformatická analýza může zahrnovat:
- Kontrola kvality dat:
- hodnocení kvality surových čtení,
- kontrolu kvality knihovny,
- hodnocení saturace sekvenování,
- statistiky počtu analyzovaných jader/buněk,
- hodnocení počtu čtení připadajících na jádro/buňku,
- hodnocení počtu detekovaných genů a molekul UMI,
- identifikaci jader nesplňujících kritéria kvality.
- Analýza genové exprese:
- mapování čtení na referenční genom,
- přiřazení čtení ke genům a jednotlivým jádrům/buňkám,
- vytvoření matice genové exprese,
- kvantifikaci a analýzu rozložení genové exprese,
- normalizaci a filtrování dat.
- Shlukování buněk a identifikace buněčných populací:
- redukci dimenzionality dat,
- shlukování jader na základě expresních profilů,
- vizualizaci výsledků pomocí UMAP nebo t-SNE,
- identifikaci markerových genů jednotlivých shluků,
- identifikaci známých typů buněk,
- charakterizaci subpopulací a buněčných stavů.
- Shlukování buněk a identifikace buněčných populací:
- redukci dimenzionality dat,
- shlukování jader na základě expresních profilů,
- vizualizaci výsledků pomocí UMAP nebo t-SNE,
- identifikaci markerových genů jednotlivých shluků,
- identifikaci známých typů buněk,
- charakterizaci subpopulací a buněčných stavů.
- Analýza diferenciální exprese:
- identifikaci diferenciálně exprimovaných genů mezi shluky,
- porovnání exprese mezi experimentálními skupinami,
- hierarchické shlukování genů s rozdílnou expresí,
- analýzu markerových genů jednotlivých buněčných populací.
- Funkční analýza:
- funkční anotaci genů,
- analýzu obohacení biologických procesů a metabolických drah,
- predikci transkripčních faktorů spojených s diferenciálně exprimovanými geny,
- analýzu proteinových interakcí,
- funkční analýzu markerových genů jednotlivých shluků,
- anotaci genů s využitím příslušných databází.
Přesný rozsah bioinformatické analýzy se stanovuje individuálně a závisí na organismu, dostupnosti kvalitního referenčního genomu, počtu vzorků a cíli projektu.