Sekvenování Hi-C

Hi-C-seq je pokročilá genomická technika umožňující studium prostorové organizace chromatinu v buněčném jádře. Metoda umožňuje identifikovat oblasti DNA, které se v prostoru nacházejí blízko sebe, i když jsou v lineární sekvenci genomu od sebe vzdáleny tisíce nebo miliony párů bází.

Hi-C-seq umožňuje vytvářet mapy chromozomálních interakcí a zkoumat vyšší úrovně organizace genomu, jako jsou chromatinové smyčky (chromatin loops), domény TAD (Topologically Associating Domains) a kontakty mezi chromozomy. Technologie hraje klíčovou roli ve výzkumu regulace genové exprese, vývojové biologie, nádorových onemocnění a epigenetických mechanismů.

Průběh procesu Hi-C seq

Proces Hi-C-seq zahrnuje několik kroků, které umožňují zachovat a identifikovat přirozené kontakty mezi úseky chromatinu.

1. 01Fixace chromatinových interakcíBuňky se fixují formaldehydem, který stabilizuje přirozené kontakty mezi úseky chromatinu nacházejícími se v prostoru buněčného jádra blízko sebe.
2. 02Štěpení chromatinuDNA se následně štěpí restrikčními enzymy na mnoha místech genomu, čímž vznikají kratší fragmenty DNA.
3. 03Ligace fragmentů ve vzájemném kontaktuPo štěpení se fragmenty DNA, které se v prostoru nacházejí blízko sebe, spojují (ligují). Vznikají tak chimérické fragmenty DNA obsahující sekvence ze vzdálených oblastí genomu, které byly v buněčném jádře ve vzájemném kontaktu.
4. 04Příprava knihovenVzniklé fragmenty se purifikují, amplifikují a opatřují sekvenačními adaptéry nezbytnými pro sekvenování.
5. 05Sekvenování NGSKnihovny Hi-C se sekvenují metodou paired-end. Získaná čtení obsahují informace o párech oblastí genomu, které byly ve vzájemném prostorovém kontaktu.

Využití Hi-C seq

Hi-C-seq umožňuje zkoumat organizaci genomu na úrovni, která je klasickým metodám sekvenování nedostupná.

Technická charakteristika Hi-C seq

• Režim sekvenování: 2 × 150 bp
• Sekvenátory: platforma Illumina, sekvenátory NovaSeq 6000 a NovaSeq X.
• Doporučená hloubka pokrytí genomu na vzorek:
  • 150x na vzorek - pro analýzu chromatinových smyček
  • 50x na vzorek - pro analýzu domén TAD
• K dispozici jsou i další konfigurace podle potřeb zákazníka.

• Doporučené požadavky na vzorky:
  • Typ vzorku:
    • Buňky: > 5x10⁷
    • Zmrazená tkáň: od 1 do 2 g

Bioinformatická analýza Hi-C seq

Analýza dat Hi-C umožňuje komplexně charakterizovat trojrozměrnou organizaci genomu, identifikovat chromatinové interakce a porovnávat změny architektury genomu mezi zkoumanými podmínkami.

• Kontrola kvality knihoven Hi-C (Hi-C Library QC) - Prvním krokem analýzy je posouzení kvality dat a správnosti přípravy knihoven Hi-C.
  • Hodnocení rozložení interakcí Hi-C - Analyzuje se rozložení chromozomových kontaktů a poměr vnitrochromozomových (cis) a mezichromozomových (trans) interakcí, což umožňuje posoudit kvalitu experimentu a účinnost ligace fragmentů DNA.
  • Analýza exponentu poklesu interakcí (Interaction Decay Exponent, IDE) - Zkoumá se závislost četnosti kontaktů na genomové vzdálenosti. Tento parametr je důležitým ukazatelem kvality dat a organizace chromatinu v analyzovaných vzorcích.
• Analýza chromatinových interakcí - Na základě namapovaných čtení se vytváří podrobná mapa prostorových kontaktů genomu.
  • Profilování interakcí Hi-C v celém genomu. Analyzují se interakce, které umožňují určit celkovou prostorovou organizaci genomu:
    • vnitrochromozomové (cis),
    • mezichromozomové (trans),
  • Kontaktní mapy Hi-C (Hi-C Heatmaps) - Vytvářejí se kontaktní matice znázorňující četnost interakcí mezi oblastmi genomu. Tyto vizualizace umožňují identifikovat chromatinové struktury na různých úrovních organizace.
  • Analýza kompartmentů A/B - Hi-C umožňuje identifikovat dva základní typy chromatinových domén:
    • Kompartment A - transkripčně aktivní oblasti bohaté na geny a otevřený chromatin,
    • Kompartment B - méně aktivní oblasti spojené s heterochromatinem..
  • Identifikace domén TAD (Topologically Associating Domains) - Detekují se genomové domény charakterizované častými vnitřními interakcemi. Domény TAD představují základní jednotky prostorové organizace chromatinu.
  • Identifikace chromatinových smyček (Chromatin Loops) - Analýza umožňuje detekovat přímé kontakty mezi vzdálenými oblastmi genomu, jako jsou promotory a enhancery, které se podílejí na regulaci genové exprese.
• Diferenciální analýza 3D struktury chromatinu - Porovnání dvou nebo více biologických skupin umožňuje identifikovat změny architektury genomu spojené s biologickými nebo patologickými procesy.
  ROZSAH BIOINFORMATICKÉ ANALÝZY4 analýzy

  Diferenciální chromatinové interakceDetekují se oblasti vykazující významné změny četnosti kontaktů mezi zkoumanými skupinami.

  Změny kompartmentů A/BAnalýza umožňuje identifikovat oblasti genomu přecházející mezi aktivním a neaktivním stavem chromatinu.

  Diferenciální analýza TADLze detekovat změny hranic domén TAD a reorganizaci jejich struktury.

  Diferenciální analýza chromatinových smyčekIdentifikují se nové nebo zaniklé regulační interakce, které mohou ovlivňovat genovou expresi.