Sekvenování transkriptů v plné délce (sekvenování transkriptomu v plné délce) je moderní metoda analýzy transkriptomu využívající technologie dlouhých čtení (long-read sequencing), která umožňuje přímo přečíst kompletní molekuly mRNA od konce 5' ke konci 3'. Na rozdíl od klasického RNA-Seq založeného na krátkých čteních umožňuje technologie sekvenování transkriptomu v plné délce identifikovat úplné izoformy transkriptů bez nutnosti jejich rekonstrukce bioinformatickými metodami.
Díky využití platforem Pacific Biosciences (PacBio) a Oxford Nanopore Technologies (ONT) lze přesně detekovat alternativní sestřih, alternativní polyadenylační místa, nové geny, dlouhé nekódující RNA (lncRNA) a další složité prvky regulace genové exprese.
Tato technologie nachází uplatnění jak v základním výzkumu, tak v translačních projektech, funkční genomice, vývojové biologii, biologii rostlin, mikrobiologii a medicíně.
Průběh sekvenování transkriptomu v plné délce
Využití sekvenování transkriptomu v plné délce
Analýza transkriptů v plné délce nachází uplatnění v mnoha oblastech biologie a genomiky:
Technická charakteristika sekvenování transkriptomu v plné délce
- Režim sekvenování: dlouhá čtení
- Příprava knihoven: selekce poly(A) pro zachycení transkriptů mRNA.
- Sekvenátory: platforma PacBio (Revio a PacBio sequel Ⅱ); ONT (Nanopore PromethION 48)
- Doporučené množství dat na vzorek pro PacBio:
- 1 mil. čtení HiFi
- 5 mil. čtení HiFi
- 10 mil. čtení HiFi
- K dispozici jsou i další konfigurace podle potřeb zákazníka.
- Doporučené množství dat na vzorek pro ONT:
- 6 Gb
- 12 Gb
- Kvalita dat:
- PacBio: 99,8 - 99,99 %
- ONT: Podíl transkriptů v plné délce＞70 %
- Doporučené požadavky na vzorky:
- Typ vzorku: celková RNA
- Množství: > 1,0 μg
- Koncentrace (NanoDrop): >100 ng/μL
- Objem: >15 μL
- Čistota:
- D260/280=1,7-2,5
- OD260/230=0,5-2,5
- Nízká nebo žádná kontaminace bílkovinami či DNA na gelu
- RIN (PacBio)
- Pro rostliny: RIN ≥ 7,5;
- Pro živočichy: RIN ≥ 8,0;
- 5,0 ≥ 28S/18S ≥ 1,0;
- RIN (ONT):
- Pro rostliny: RIN ≥ 7,0;
- Pro živočichy: RIN ≥ 7,5;
- 5,0 ≥ 28S/18S ≥ 1,0;
- Je možná také izolace RNA z dodaných vzorků. Podrobnosti zde.
Bioinformatická analýza sekvenování transkriptomu v plné délce
Komplexní bioinformatická analýza sekvenování transkriptomu v plné délce zahrnuje strukturní charakterizaci transkriptů i funkční a kvantitativní analýzu.
- Posouzení úplnosti transkriptů a odstranění redundance
- Posouzení úplnosti transkriptů: V této fázi se identifikují úplné transkripty obsahující:
- kompletní oblasti 5' UTR,
- CDS,
- oblasti 3' UTR,
- polyadenylační signály.
Odstranění redundance transkriptů: Opakující se transkripty se seskupují a slučují, čímž vzniká soubor jedinečných izoforem využívaných v dalších analýzách.
- Identifikace lncRNA a analýza cílových genů zahrnující:
- identifikaci kandidátních lncRNA,
- klasifikaci lncRNA,
- predikci cílových genů,
- analýzu potenciálních regulačních mechanismů.
- Analýza funkčních prvků transkriptů:
- SSR (jednoduché sekvenční repetice)
- CDS (kódující sekvence)
- TF (transkripční faktory)
- AS (alternativní sestřih)
- APA (alternativní polyadenylace)
- Analýza genové exprese
- Funkční anotace a analýza obohacení
Vybrané realizované projekty a publikace našich zákazníků
Podívejte se, pro které instituce provádíme sekvenování NGS a v jakých publikacích byla využita námi dodaná data.