Genový panel je vhodnou volbou, pokud je zkoumané onemocnění nebo znak spojen s jasně vymezenou skupinou genů a je zapotřebí vysoká hloubka sekvenování. WES umožňuje širší vyhledávání variant v kódujících oblastech, zatímco WGS poskytuje nejkomplexnější analýzu genomu, která zahrnuje také nekódující oblasti a širší spektrum strukturních variant.
Volba metody by měla vycházet z cíle projektu, typu materiálu, očekávaných variant, požadované citlivosti a možností interpretace dat.
Porovnání metod
| Kritérium | Genový panel | WES | WGS |
|---|---|---|---|
| Rozsah analýzy | Vybrané geny nebo oblasti | Kódující oblasti - exom | Téměř celý genom |
| Podíl analyzovaného genomu | Velmi malý, závisí na panelu | Přibližně 1-2 % genomu | Kódující a nekódující oblasti |
| SNV a malé indely | Velmi dobrá detekce v oblastech panelu | Velmi dobrá detekce v exomu | Velmi dobrá detekce v celém genomu |
| CNV | Možná, v závislosti na návrhu projektu a validaci | Možná, s omezeními | Obvykle širší možnosti |
| Strukturní varianty | Omezený rozsah | Omezený rozsah | Nejširší možnosti z těchto metod |
| Regulační oblasti a hluboké intronové oblasti | Pouze pokud jsou zahrnuty v panelu | Obvykle ne | Ano |
| Hloubka pokrytí cílových oblastí | Nejvyšší | Vysoká, ale závisí na účinnosti obohacení | Nižší při stejném počtu čtení, ale rovnoměrnější |
| Varianty s nízkou frekvencí alely | Dobrá detekce při vysoké hloubce pokrytí a použití UMI | Možná při dostatečné hloubce sekvenování | Vyžadují dostatečně vysokou hloubku pokrytí |
| Objem dat | Nejmenší | Střední | Největší |
| Složitost analýzy | Nejmenší | Střední | Největší |
| Možnost opakované analýzy | Pouze oblasti panelu | Celý exom | Prakticky celý genom |
| Náklady | Obvykle nejnižší | Střední | Nejvyšší |
Kdy zvolit WGS?
Zvolte Whole Genome Sequencing, pokud:
- potřebujete co nejkomplexnější analýzu genomu,
- předchozí analýza pomocí panelu nebo WES neobjasnila zkoumaný fenotyp,
- zajímají vás varianty v nekódujících či regulačních oblastech nebo hluboko v intronech,
- chcete analyzovat SNV, indely, CNV a strukturní varianty na základě jediné datové sady,
- je důležité rovnoměrnější pokrytí genomu bez kroku hybridizačního obohacení,
- má projekt umožnit opakovanou analýzu dat v budoucnu,
- analyzujete organismus, pro který nejsou dostupné WES nebo vhodný panel.
WGS nevyžaduje selektivní zachycení cílových oblastí. Omezuje tak zkreslení spojené s hybridizací sond a umožňuje analyzovat oblasti, které nepokrývá WES ani standardní genový panel.
Širší rozsah však neznamená, že bude každý typ varianty detekován se stejnou účinností. Analýza repetitivních oblastí, některých strukturních variant a expanzí repetic může vyžadovat specializované algoritmy, dodatečnou validaci nebo sekvenování dlouhých čtení.
Kdy zvolit WES?
Zvolte celoexomové sekvenování, pokud:
- předpokládáte, že se příčina zkoumaného fenotypu nachází v kódující oblasti,
- je seznam potenciálních genů dlouhý nebo dosud nebyl stanoven,
- analyzujete vzácné nebo geneticky heterogenní onemocnění,
- projekt zahrnuje analýzu tria: proband a rodiče,
- chcete identifikovat nové kandidátní geny,
- potřebujete širší rozsah než u panelu při nižších nákladech a menším množství dat než u WGS.
WES využívá hybridizační sondy k záchytu exonů a vybraných přilehlých oblastí významných pro sestřih RNA. Metoda se zaměřuje přibližně na 1-2 % lidského genomu, ale zahrnuje mnoho variant přímo ovlivňujících strukturu a funkci proteinů.
Rozsah WES závisí na použité soupravě pro obohacení. Ne všechny exony jsou pokryty rovnoměrně a oblasti s vysokým obsahem GC, pseudogeny a homologní sekvence mohou být obtížně analyzovatelné.
Kdy zvolit genový panel?
Zvolte genový panel, pokud:
- zkoumané onemocnění nebo fenotyp souvisí se známou skupinou genů,
- potřebujete vysokou hloubku pokrytí vybraných oblastí,
- cílem je detekce variant s nízkou frekvencí alely,
- analyzujete nádorový materiál, vzorky FFPE nebo cfDNA,
- projekt zahrnuje velký počet vzorků,
- je třeba zajistit krátkou dobu analýzy a omezený počet variant k interpretaci,
- chcete použít identifikátory UMI k omezení vlivu technických chyb.
Panel může zahrnovat několik až několik set genů. Kromě exonů do něj lze zahrnout vybrané regulační oblasti, sestřihová místa, introny nebo mutační hotspoty.
Hlavním omezením panelu je pevně daný rozsah analýzy. Varianta ležící mimo navržené oblasti nebude detekována a rozšíření vyšetření může vyžadovat přípravu nové knihovny.
Požadavky na vzorky
Požadavky závisí na způsobu přípravy knihovny, typu materiálu, požadované hloubce sekvenování a použití identifikátorů UMI.
Standardní materiál pro WGS a WES
Doporučuje se:
- purifikovaná genomová DNA,
- alespoň 150 ng DNA pro standardní pracovní postup Illumina,
- koncentrace alespoň 15 ng/µL (WES), 10 ng/µL (WGS) měřená pomocí Qubit
- odpovídající objem v souladu s požadavky uvedenými spolu s nabídkou,
- měření koncentrace fluorometrickou metodou, např. pomocí Qubit,
- OD260/280 nejčastěji v rozmezí přibližně 1,8-2,0,
- co nejnižší míra degradace,
- nepřítomnost alkoholu, solí, detergentů a dalších inhibitorů.
Genový panel
Požadované množství DNA závisí na typu panelu a materiálu. Analyzovat lze i menší množství DNA, vzorky FFPE, tekuté biopsie a cfDNA však vyžadují individuální posouzení vhodnosti.
U těchto projektů je třeba uvést:
- typ materiálu a způsob jeho fixace,
- množství a koncentraci DNA,
- stupeň degradace,
- podíl nádorových buněk,
- očekávanou frekvenci variantní alely,
- dostupnost odpovídajícího nenádorového vzorku - matched normal.
Malé množství DNA nemusí vždy znamenat nevhodnost vzorku, může však omezit citlivost analýzy a zvýšit riziko artefaktů.
Orientační množství dat a pokrytí
Genový panel
Množství dat závisí na velikosti panelu a požadované citlivosti. Typická průměrná hloubka pokrytí může dosahovat:
- přibližně 100-250× při analýzách zárodečných variant,
- přibližně 500-1000× nebo více při somatických analýzách,
- ještě vyšší hrubé hloubky pokrytí při analýzách cfDNA, zejména s použitím UMI.
U UMI je důležitá nejen hrubá hloubka pokrytí, ale také počet nezávislých molekul a hloubka konsenzuálního pokrytí po deduplikaci.
WES
Orientační možnosti zahrnují:
- přibližně 5 Gb dat na vzorek - což orientačně odpovídá průměrné hloubce pokrytí přibližně 50×,
- přibližně 10 Gb na vzorek - často využívaných k dosažení vyšší hloubky pokrytí, např. přibližně 100×,
- větší množství dat při somatických analýzách nebo při očekávané nízké frekvenci alely.
Při hodnocení kvality WES je třeba zohlednit nejen průměrnou hloubku pokrytí, ale také podíl cílových oblastí dosahujících alespoň 20×, 30× nebo jiné hodnoty požadované v projektu.
WGS
U lidského genomu se nejčastěji používá:
- přibližně 90 Gb čistých dat jako hodnota teoreticky odpovídající hloubce pokrytí 30× u genomu o velikosti 3 Gb,
- v praxi často přibližně 90-120 Gb dat na vzorek v závislosti na způsobu vykazování, kvalitě čtení a požadované efektivní hloubce pokrytí,
- přibližně 30× při standardní analýze zárodečných variant,
- vyšší hloubka pokrytí při somatických analýzách, analýzách mozaicismu nebo analýzách vyžadujících detekci variant s nízkou frekvencí alely.
Konečné množství dat by mělo být vypočteno na základě rozsahu vyšetření, cíle analýzy, kvality materiálu a očekávané citlivosti.
Časté chyby při výběru metody
Otázky pro plánování projektu
Před výběrem metody si ujasněte:
Naplánujte si projekt
Popište projekt - vybereme vhodnou metodu a množství dat.
Na základě cíle výzkumu a typu materiálu vám pomůžeme vybrat genový panel, WES nebo WGS. Navrhneme také způsob přípravy knihovny, vhodnou hloubku sekvenování a rozsah bioinformatické analýzy.
Vybrané realizované projekty a publikace našich zákazníků
Podívejte se, pro které instituce provádíme sekvenování NGS a v jakých publikacích byla využita námi dodaná data.