Metatranskriptomika analyzuje RNA mikrobiálního společenstva a umožňuje zjistit, které geny se za zkoumaných podmínek exprimují. Zvolte ji, pokud chcete posoudit reakci mikrobiomu na změnu prostředí, stravy nebo na aplikovaný zásah. Pokud vás zajímá především složení mikrobiomu a přítomnost genů s určitými funkcemi, vhodnější bude shotgun metagenomika.
Metatranskriptomika a shotgun metagenomika
| Vlastnost | Metatranskriptomika | Shotgun metagenomika |
|---|---|---|
| Materiál | RNA přepsaná do cDNA | DNA |
| Hlavní otázka | Které geny se exprimují? | Jaké mikroorganismy a geny jsou přítomny? |
| Informace o funkcích | Genová exprese a přiřazení genů k funkcím a drahám | Funkční potenciál zakódovaný v genech |
| Omezení | Hladina RNA není přímým měřítkem aktivity enzymů | Přítomnost genu nepotvrzuje jeho expresi |
Co zvolit?
Zvolte metatranskriptomiku, pokud plánujete porovnat genovou expresi mikrobiomu mezi skupinami, podmínkami nebo časovými body. Analýza může zahrnovat sestavování transkriptů, taxonomické přiřazení, funkční anotaci a analýzu rozdílů mezi skupinami, mimo jiné s využitím GO, KEGG, eggNOG, CAZy nebo CARD.
Zvolte shotgun metagenomiku, pokud chcete určit složení společenstva a detekovat geny související například s metabolismem nebo rezistencí vůči antibiotikům.
Obě metody lze kombinovat u stejných vzorků. Data DNA pomáhají určit, zda změna signálu RNA souvisí se změnou exprese, nebo se změnou zastoupení daného mikroorganismu ve společenstvu.
Požadavky na vzorek
Výchozím materiálem je celková RNA. Příprava knihoven zahrnuje odstranění ribozomální RNA a přípravu knihoven zachovávajících informaci o orientaci transkriptů. Orientační požadavky na izolovanou RNA jsou uvedeny níže.
| Parametr | Požadavek |
|---|---|
| Celkové množství | ≥1 µg |
| Koncentrace | ≥50 ng/µL |
| Objem | ≥20 µL |
| Integrita | RIN ≥6,5 |
| Čistota A260/A280 | 1,8-2,0 |
| Čistota A260/A230 | 1,0-2,5 |
Množství biologického materiálu potřebného pro izolaci stanovujeme podle typu vzorku. Způsob odběru, stabilizace a přepravy je vhodné dohodnout před zahájením experimentu. Materiál je nutné rychle ošetřit tak, aby byla RNA chráněna před degradací, a ve všech skupinách použít stejný postup.
Orientační objem dat
Doporučené množství dat je 12 Gb dat na vzorek v režimu Illumina PE150, tedy 2 × 150 nukleotidů. To odpovídá přibližně 40 mil. párů čtení, tedy 80 mil. jednotlivých čtení v plné délce.
Cílové množství dat volíme podle komplexity mikrobiomu, podílu RNA hostitele a cíle analýzy. Po odfiltrování rRNA, sekvencí hostitele a čtení nízké kvality bude využitelných dat méně. V cenové nabídce je třeba upřesnit, zda se uvedené množství vztahuje na surová data, nebo na data po filtraci.
Časté chyby
Otázky pro přípravu plánu projektu
Popište projekt - vybereme vhodnou metodu a množství dat.
Vybrané realizované projekty a publikace našich zákazníků
Podívejte se, pro které instituce provádíme sekvenování NGS a v jakých publikacích byla využita námi dodaná data.