Pokrycie WGS dobieramy do celu badania: 0,5-5× może sprawdzić się w projektach populacyjnych z odpowiednią analizą statystyczną, 15× bywa kompromisem między kosztem a dokładnością, a 30× jest częstym punktem wyjścia do identyfikacji wariantów pojedynczego osobnika. Pokrycie około 100× rozważa się m.in. w badaniach nowotworów, gdy poszukiwane warianty występują tylko w części cząsteczek DNA. Ostateczny wybór zależy również od organizmu, ploidalności, jakości materiału i oczekiwanej czułości analizy.
Poniższe porównanie dotyczy przede wszystkim WGS krótkimi odczytami z mapowaniem do genomu referencyjnego, np. Illumina PE150. Projekty składania genomu de novo, sekwencjonowanie długimi odczytami oraz analiza poliploidów wymagają osobnego doboru parametrów.
Co oznacza pokrycie genomu?
Pokrycie 30× oznacza, że każda pozycja genomu jest odczytana średnio 30 razy. Nie oznacza to jednak, że każdy fragment będzie reprezentowany dokładnie przez 30 odczytów (część regionów uzyska większe pokrycie, a część mniejsze lub pozostanie nieodczytana).
Dlatego przy ocenie wyników warto uwzględnić także równomierność pokrycia oraz odsetek genomu osiągający ustalony próg, np. co najmniej 10× lub 20×.
Porównanie: które pokrycie do jakiego projektu?
| Pokrycie | Kiedy warto rozważyć? | Główna korzyść | Najważniejsze ograniczenie |
|---|---|---|---|
| 0,5× | Duże projekty populacyjne; profilowanie dużych zmian liczby kopii w odpowiednio zaplanowanym badaniu | Niski koszt sekwencjonowania jednej próbki | Wiele pozycji nie ma bezpośredniego odczytu; nie pozwala na samodzielne, dokładne genotypowanie całego genomu |
| 5× | Analiza różnorodności i struktury populacji; genotypowanie wspierane modelami uwzględniającymi niepewność genotypu | Możliwość przebadania większej liczby osobników | Ograniczona pewność genotypów, zwłaszcza heterozygotycznych |
| 15× | Projekty resekwencjonowania, w których dopuszczalna jest niższa czułość niż przy 30× | Kompromis między ilością danych a kosztem | Większe ryzyko pominięcia wariantów w słabiej pokrytych regionach |
| 30× | Identyfikacja SNP i małych indeli u pojedynczych osobników diploidalnych | Większa pewność genotypowania i mniejsza zależność od imputacji | Nie gwarantuje wykrycia wszystkich wariantów ani pełnego odczytania regionów powtarzalnych |
| 100× | Wybrane projekty onkologiczne i analizy wariantów o obniżonym udziale allelu | Więcej odczytów mogących potwierdzić wariant | Wyższy koszt; nadal ograniczona czułość dla bardzo niskiego udziału wariantu |
To orientacyjna mapa wyboru, a nie uniwersalne progi jakości. Przy niskim pokryciu kluczowa jest metoda analizy; przy większym: jakość mapowania i charakter poszukiwanych zmian.
Kiedy wybrać niższe, a kiedy wyższe pokrycie?
0,5× czy 5×: gdy najważniejsza jest duża liczba próbek
0,5× warto rozważyć, gdy planujesz dużą kohortę i masz dostęp do odpowiedniego panelu referencyjnego do statystycznego uzupełniania brakujących lub niepewnych genotypów. Skuteczność tego podejścia zależy od zgodności panelu z badań populacją i częstości analizowanych wariantów.
5× warto rozważyć, gdy potrzebujesz więcej bezpośrednich obserwacji sekwencji, ale nadal priorytetem pozostaje liczebność badanej populacji. Analiza powinna uwzględniać niepewność genotypów (samo zwiększenie pokrycia z 0,5× do 5× nie usuwa wszystkich ograniczeń nisko pokryciowego WGS).
Brak panelu referencyjnego nie zawsze wyklucza statystyczne uzupełnianie brakujących lub niepewnych genotypów, ale wymaga odpowiednio licznego zbioru próbek, włąściwych metod i walidacji. Nie należy automatycznie przenosić wyników uzyskanych dla człowieka na gatunki nie modelowe.
15× czy 30×: gdy liczy się genotyp konkretnego osobnika
15× można wybrać, jeśli projekt dopuszcza część brakujących lub mniej pewnych genotypów, a zaoszczędzony budżet pozwoli zwiększyć liczbę próbek biologicznych.
30× jest najczęściej wybieranym punktem wyjścia, gdy priorytetem jest pewne rozróżnianie homozygot i heterozygot oraz identyfikacja wariantów bez silnego polegania na statystycznym uzupełniania brakujących lub niepewnych genotypów. W przypadku ludzkiego WGS typowe zalecenia obejmują około 30-50×, zależnie od zastosowania i modelu analizy.
30× czy 100×: gdy wariant występuje tylko w części DNA
W próbce nowotworowej udział wariantu zależy m.in. od zawartości komórek nowotworowych, subklonalności i zmian liczby kopii. Dlatego projekt często wymaga większego pokrycia oraz dopasowanej próbki prawidłowej.
100× nie oznacza gwarantowanego wykrywania wariantów o udziale 1%. Przy lokalnym pokryciu 100× taki wariant daje średnio zaledwie jeden odczyt alternatywny. To wyliczenie ilustracyjne, a nie próg wykrywalności; przy bardzo niskim udziale wariantu warto rozważyć głębokie sekwencjonowanie celowane.
Wymagania dotyczące próbki
Dla standardowego WGS Illumina wymagania obejmują:
| Parametr | Wymaganie |
|---|---|
| Materiał | Genomowe DNA - gDNA |
| Całkowita ilość DNA | >50 ng |
| Stężenie | >10 ng/µl |
| Objętość | >20 µl |
| Czystość A260/A280 | 1,7- 2,2 |
Wymagania dotyczące ilości, stężenia i objętości należy spełnić jednocześnie. Zalecamy przesłanie zapasu materiału na kontrolę jakości i przygotowanie biblioteki. Szczegóły znajdują się w opisie usługi WGS.
Niższe pokrycie nie oznacza automatycznie mniejszej wymaganej ilości DNA: materiał wejściowy zależy przede wszystkim od sposobu przygotowania biblioteki. Dla DNA zdegradowanego, FFPE, cfDNA lub małej ilości materiału warunki należy ustalić indywidualnie. Dostępne protokoły różnią się wymaganiami wejściowymi.
Ile danych potrzeba?
Podstawowe przeliczenie jest proste:
Ilość danych [Gb] = wielkość genomu referencyjnego [Gb] × planowane pokrycie
Dla organizmu diploidalnego pokrycie standardowo odnosi się do długości genomu haploidalnego nie mnożymy jej ponownie przez dwa.
Poniżej przykładowe obliczenia dla genomu o wielkości 3,0 Gb i odczytów PE150, czyli 2 × 150 bp:
| Pokrycie | Teoretyczna ilość danych | Liczba par odczytów PE150 |
|---|---|---|
| 0,5× | 1,5 Gb | 5 mln |
| 5× | 15 Gb | 50 mln |
| 15× | 45 Gb | 150 mln |
| 30× | 90 Gb | 300 mln |
| 100× | 300 Gb | 1 mld |
Obliczenia własne; wartości przed uwzględnieniem strat danych.
Jedna para PE150 dostarcza nominalnie 300 zasad. Gb oznacza miliard zasad, a GB gigabajt pamięci; nie są to jednostki zamienne.
W praktyce trzeba uwzględnić odczyty odrzucone podczas kontroli jakości, niezmapowane oraz duplikaty. Przykładowo, przy założeniu 80% danych użytecznych uzyskanie 90 Gb efektywnie wykorzystanych zasad wymaga około 112,5 Gb danych surowych. To przykład obliczeniowy, rzeczywisty zapas zależy od próbki i biblioteki.
Przed zamówieniem należy ustalić, czy oferta określa ilość danych surowych, oczyszczonych, czy docelowe pokrycie po mapowaniu i filtracji.
Typowe błędy przy wyborze pokrycia
Jakie informacje uwzględnić w briefie?
Aby dobrać metodę i ilość danych, podaj:
Opisz projekt, a my pomożemy dobrać metodę i ilość danych
Prześlij informacje o organizmie, próbkach i celu badania. Pomożemy dobrać technologię, pokrycie oraz zakres analizy bioinformatycznej do pytania, na które ma odpowiedzieć Twój projekt.
Wybrane realizacje i publikacje naszych klientów
Sprawdź, dla jakich instytucji wykonujemy sekwencjonowanie NGS i w jakich publikacjach wykorzystano dostarczone przez nas dane.